蛋白质N磷酸化修饰富集方法进展

　　蛋白质N-磷酸化修饰富集方法进展

　　江波1, 高博2, 魏淑娴2, 梁振1, 张丽华1,*, 张玉奎1

　　1.中国科学院大连化学物理研究所,医学蛋白质组全国重点实验室,国家色谱研究中心, 中国科学院分离分析化学重点实验室,辽宁 大连 116023

　　2.中国石油大学(华东)化学化工学院,山东 青岛 266580

　　蛋白质磷酸化作为一种最普遍和最重要的翻译后修饰调控着几乎所有的生命过程。随着高效富集方法和生物质谱技术的快速发展,低丰度的蛋白质O-磷酸化修饰获得了规模化鉴定,从而使其生物学功能得到较为透彻的研究。而发生在组氨酸、赖氨酸和精氨酸侧链氨基的N-磷酸化修饰,由于P-N键化学稳定性差,导致其在酸和热条件下不稳定。而目前依赖酸性条件的O-磷酸化富集方法难以适用N-磷酸化富集,导致蛋白质N-磷酸化生物功能研究严重滞后。因此,迫切需要发展针对蛋白质N-磷酸化的高效富集方法。本文首先介绍了蛋白质N-磷酸化的结构特征和已报道的生物学功能,重点综述并分析了近20年来蛋白质N-磷酸化修饰富集方法,并对每一种富集方法的优缺点进行了评述,最后对潜在的富集方法进行了展望。

　　蛋白质N-磷酸化的重要生物功能

　　1.1 pHis的生物功能

　　1.2 pArg的生物功能

　　蛋白质N-磷酸化修饰富集方法

　　近20年来蛋白质O-磷酸化修饰富集方法得到了长足进步,超过数万个O-磷酸化位点被规模化鉴定出来,规模化鉴定进一步促进了O-磷酸化生物功能的研究,如针对酪氨酸磷酸化的激酶抑制剂被开发用于肿瘤治疗。然而,N-磷酸化功能研究还处于起步阶段,主要原因是N-磷酸化修饰的化学性质不稳定,难以实现规模化鉴定。N-磷酸化修饰中P-N酰胺键水解吉布斯自由能较高,在酸和热条件下不稳定。然而,目前针对O-磷酸化的富集方法需要强酸富集条件,并不适用于N-磷酸化富集。因此,亟需发展针对N-磷酸化修饰的富集方法,以实现其规模化鉴定。本文总结了近20年来N-磷酸化修饰富集方法进展,以供读者在研究其生物学功能时使用。

　　2.1 亲和富集法

　　2.2 固定化金属离子色谱(IMAC)材料

　　2.3 Phos-Tag功能化材料

　　2.4 金属氧化物色谱(MOAC)

　　2.5 化学标记法

　　2.6 蛋白质N-磷酸化富集存在的问题

　　结论与展望

　　本文总结了近20年来蛋白质N-磷酸化修饰富集方法的研究进展,亲和抗体、IMAC、Phos-Tag功能化材料、MOAC、化学标记法已经被开发用于N-磷酸化修饰的富集研究。通过这些方法已经有超过数千个N-磷酸化位点被鉴定到,这些方法可用于原核生物和哺乳动物N-磷酸化位点的发现。利用已经发现的位点,研究人员建立了N-磷酸化位点数据库。这些研究极大地促进了N-磷酸化的研究。尽管N-磷酸化富集方法研究取得了一定进展,但相对于O-磷酸化富集方法,N-磷酸化富集方法发展依旧滞后。随着生物技术、化学合成和材料科学的发展,一些新富集策略可尝试用于N-磷酸化修饰的富集研究。

　　智能聚合物基材料通过外部物理、化学或生物刺激可逆地改变其结构和功能,可实现对磷酸化肽高度可控的吸附和脱附,实现高选择性富集。一方面,智能聚合物基材料的响应变化包括材料疏水性的增加或减少、形状和形貌的改变、表面电荷的重新分布以及亲和配体的暴露或隐藏等特性。这些特性使得磷酸化肽段和智能聚合物基材料之间的亲和力可以通过简单改变外部条件(如温度、pH值、溶剂极性和生物分子等)而改变,进而实现更可控和更智能的精细调节。另一方面,智能聚合物基材料为集成功能模块提供了便捷的可扩展平台,例如特定的识别组件,显著提高磷酸化肽段的分离选择性。如杨海波等通过结合金属配位自组装和后修饰的聚合反应,制备了一种新型的以有机铂金属大环为核心骨架的超分子聚合物。该超分子聚合物同时包含氢键和静电相互作用等多种磷酸根识别位点,因此对磷酸化肽的结合具有较高的选择性,金属环骨架上的多个正电荷使聚合物层与层之间通过静电排斥彼此分离,从而形成稳定且易于转移的二维超分子聚合物。因此,有利于增加磷酸化肽与聚合物材料间的接触面积,从而实现在水溶液中快速高效地捕获磷酸化肽。通过简单的水洗和离心即可方便地除去非磷酸化肽。同时,得益于聚合物核心骨架独特的刺激响应性能以及与磷酸化肽在响应前后结合能力的巨大差异,该智能超分子聚合物可以在中性条件下实现对磷酸化肽有效的洗脱与释放。研究结果展现了对N-磷酸化肽段高效的富集潜力。

　　基于色谱的富集方法是实现N-磷酸化修饰高效富集的重要手段,Eyers等利用强阴离子色谱作为富集手段,通过调节富集pH值,在中性条件下实现了N-磷酸化肽段的高效富集。类似的原理,发展亲水相互作用色谱,利用亲水固定相和N-磷酸化肽段之间亲水作用,也可在中性条件下实现N-磷酸化肽段的有效富集。另外可以制备分子印迹聚合物,虽然难以实现N-磷酸化肽段/蛋白质规模化富集,但是适用于单个N-磷酸化肽段/蛋白质的富集,如制备NDPK-B的分子印迹聚合物,利用化学性质和结构匹配实现NDPK-B的选择性富集。