蛋白酶的测定实验——酪蛋白测定法

实验中的氨基酸由蛋白酶从酪蛋白中水解下来。在分离出 TCA 沉淀中未分解的蛋白质后，用分光光度测定的方法对其上清液分析，氨基酸来自于酪蛋白。依据酪蛋白校准曲线，已对其量化。这个鉴定不是很敏感。

酶样品

Tris-HClNaOH乙酸三氯乙酸L-酪氨酸酪蛋白底物

分光光度计

实验所需「试剂」具体见「其他」

0.4 ml 酪蛋白底物被恢复到 35℃，并加入 0.2 ml 蛋白酶溶液（含 0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0，10 mmol/L CaCl₂）。混合物在 35℃ 孵育 10 min，加入 1 ml 1.2 mol/L 的 TCA 停止反应。用同样方法处理空白对照，不同的是在加入 TCA 之后向酪蛋白底物中加蛋白酶溶液。样品离心 5 min，并取上清液测量其在 275nm 处的吸收值。

一个单位被定义为：35℃ 时，1 min 后，产生相当于校准曲线中 1 umol 的酪氨酸所产生的吸收值的蛋白酶量。校准曲线是用不同浓度的酪氨酸溶液绘制的。

试剂：

0.01 mol/L Tris-HCl，pH8.0，包含 10 mmol/L CaCl₂

0.2 mol/L NaOH（Mr＝40.0；0.8 g 溶于 100 ml 水中）

0.2 mol/L 乙酸（Mr＝60.05；12 g 加到 1 L）

1.2 mol/L 三氯乙酸（TCA，Mr＝163.4；19.6 g 溶于 100 ml 水中）

1 mmol/L L-酪氨酸（Mr＝181；18.1 mg 溶于 100 ml 0.2 mol/L HCl）

酪蛋白底物：2 g 酪蛋白溶于 90 ml 0.01 mol/L Tris-HCl pH 8.0、10 mmol/L CaCl₂ 和 0.2 mol/L NaOH，而后用 0.2 mol/L 的乙酸调 pH 至 8.0，并用 H₂O 将溶液补充至 100 ml。溶液被分为等分试样并储存于 -20℃。