蜜环菌漆酶对蒽醌类染料的脱色条件优化方法

目前全世界每年约产染料70万t，我国年产量已达15万t，这其中约有10%～15%排放到环境中［1］．且有些染料残留可能致畸变或癌变，严重威胁人类生存环境［2］．染料废水通常通过物理或化学方法处理，包括吸附、光催化、膜过滤等，物理化学处理法虽然对废水色度去除率较高，但COD去除率较低，且存在处理费用高、可能引起二次污染等问题［3～4］．因此寻找清洁环保的染料降解脱色技术是目前一项迫切的任务．
    漆酶(Laccase，EC1.10.3.2)是一类可降解木质素的含铜多酚氧化酶，漆酶能促进木质素及其前体物质分子或前体物质分子类似物等环境污染物的降解，在纸浆生物漂白、染料的脱色及其废水净化、污染物质脱毒与降解等方面有着巨大的应用潜力［5］．
    采用漆酶直接对染料进行脱色降解，以及利用漆酶介体系统，漆酶染料中间体和固定化漆酶对染料降解的研究已引起了国内外的广泛关注并取得了较好的脱色降解效果［6～11］．蜜环菌是一种重要的药用真菌，也是一种木腐菌，有较强的木质素分解能力，蜜环菌的木质素分解能力与其代谢过程中合成的木质素相关分解酶有关，对蜜环菌的前期发酵研究表明，蜜环菌在次级生长代谢阶段能合成一定量的胞外漆酶，蜜环菌漆酶具有较好的热稳定性，使该酶在多酚类化合物脱毒转化和印染废水脱色降解等环境保护中具有潜在应用价值［12］．目前对蜜环菌漆酶及其应用方面的研究较少，本研究从蜜环菌漆酶的应用入手，主要分析了蜜环菌粗漆酶液对印染工业中的2种常见蒽醌类染料:活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR进行脱色研究，优化其脱色降解条件，以期为蜜环菌漆酶在印染废水脱色净化方面的应用奠定基础．
    1·材料与方法
    1.1菌株与试剂
    蜜环菌(Amillariella mellea)购自中国科学院微生物研究所，活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR购自浙江闰土股份有限公司，其它试剂均为国产分析纯．
    1.2培养基
    固体种子培养基:综合马铃薯培养基(CPDA)(g·L－1):葡萄糖20 g，新鲜土豆200 g(煮沸30 min取滤液)，KH2PO4 3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB110mg，水1 000 mL，pH自然．基础产酶培养基［13］(质量分数，有小部分调整):葡萄糖2%，蛋白胨0.2%，MgSO4·7H2O0.15%，KH2PO4 0.3%，CaCl20.001%，VB10.001%，微量元素80 mL．微量元素混合液组成［14］:氨基乙酸7.8×10－3mol，MgSO4·7H2O 1.2×10－2mol，MnSO4·H2O 2.9×10－3mol，NaCl 1.7×10－2 mol，FeSO4·7H2O 3.59×10－4mol，CoCl27.75×10－4mol，CaCl2·2H2O 9.0×10－4mol，ZnSO4·7H2O 3.48×10－4mol，CuSO4·5H2 O 4×10－5mol，KAl(SO4)2·12H2O 2.1×10－5mol，HBO31.6×10－4mol，NaMnO44.1×10－5mol．
    1.3粗酶液的的制备
    取产酶高峰期的发酵液，于4 000 r·min－1常温离心15 min，上清液即为漆酶粗提液．
    1.4漆酶酶活的测定［15］
    以愈创木酚为底物，4 mL 50 mmol·L－1(含1mmo·lL－1愈创木酚)琥珀酸钠缓冲液(pH4.5)，加入1 mL酶样液，混合均匀后置于30℃水浴保温反应30 min，于465 nm处测光吸收值．定义每min氧化1μmol愈创木酚的酶量为一个酶活力单位．
    1.5活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR吸收光谱的测定
    用蒸馏水把活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR配成2 g·L－1的母液，测定时将溶液稀释到线性范围内，以蒸馏水为参比，进行光谱扫描活性艳蓝KN-R的最大吸收峰在592 nm处(图1)，活性艳蓝X-BR的最大吸收峰在600 nm(图2)．
    1.6染料脱色方法
    脱色条件采用:选用的脱色体系总体积为10mL，用柠檬酸-Na2HPO4缓冲液把脱色体系的pH值调至5，给酶量0.1 U·mL－1，温度为30℃，活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR的浓度分别采用50 mg·L－1和100 mg·L－1．脱色率的计算方法:采用紫外分光光度计在染料的最大吸收波长下测出吸光度，根据标准曲线转化成相应的质量浓度，染料脱色率(%)的计算公式［16］:脱色率(%)=(A0－At)/A0×100%式中:A0、At分别表示初始时刻和t时刻染料在特征波长处的吸光值浓度吸光值．实验重复3次，取平均值．
    2·结果与分析
    2.1时间对脱色率的影响
    从图3可以看出活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR的脱色率随时间增加而增大，活性艳蓝X-BR和活性艳蓝KN-R分别到第6 h和第5 h后的脱色率不再随时间增加而增加，维持在一个稳定范围;这时的活性艳蓝KN-R脱色率达83.02%，活性艳蓝X-BR脱色率达50.02%．因此以后实验活性艳蓝KN-R脱色时间选为6 h，活性艳蓝X-BR脱色时间选为5 h．
    2.2温度对脱色率的影响
    从图4中看出随着温度的升高，活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR的脱色率都在逐渐升高，当温度为30℃时它们的脱色率都达到最高．而当温度继续升高，脱色率迅速下降这是因为温度升高酶的失活越来越明显，能用于催化反应的酶减少因而脱色率降低．
    2.3 pH值对脱色的影响
    从图5可以看出pH值的变化对活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR的脱色率有很大影响，pH在4～6之间它们的脱色效果都很好，活性艳蓝KN-R的最适pH为5，活性艳蓝X-BR的最适pH为4.这是因为pH值的变化会改变离子平衡和蛋白质的解离状态，对酶的活性造成很大影响．
    2.4染料浓度对脱色的影响
    从图6中可以看出随染料的质量浓度增加，活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR脱色率都在增加，活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR分别在80mg·L－1和50 mg·L－1时脱色率达到最高，分别为84.2%和52.2%．但是染料浓度继续增大脱色率反而降低，这说明高浓度的染料对蜜环菌漆酶催化脱色的能力有一定的抑制作用．
    2.5酶量对脱色的影响
    由图7看出随着酶量的增加，脱色率亦逐渐增加，活性艳蓝KN-R和活性艳蓝X-BR分别在酶量0.25 U·mL－1和0.5 U·mL－1时后增加缓慢．原因是酶的用量决定催化反应的速度，用量增加能与底物结合的活性中心也就增多，当酶饱和以后反应速度就不会随酶量增加而加快．
    2.6最优条件下脱色效果
    活性艳蓝KN-R在温度为30℃，染料浓度为80mg·L－1，酶活为0.25 U·mL－1，pH值为5的条件下作用6 h，脱色率为90.33%．活性艳蓝X-BR在温度为30℃，染料浓度为50 mg·L－1，酶量为0.5U·mL－1，pH值为4的条件下作用5 h，脱色率为70.03%．
    3·结论
    (1)实验研究了蜜环菌漆酶对活性艳蓝KN-R的脱色条件，表明蜜环菌粗漆酶液对活性艳蓝KN-R有很好的脱色效果．在温度为30℃，染料浓度为80mg·L－1，酶量为0.25 U·mL－1，pH值为5的条件下作用6 h活性艳蓝KN-R在脱色率能达90%以上．
    (2)实验研究了蜜环菌漆酶对活性艳蓝X-BR的脱色条件，表明蜜环菌粗漆酶液对活性艳蓝KN-R有较好的脱色效果．在温度为30℃，染料浓度为50mg·L－1，酶量为0.5 U·mL－1，pH值为4的条件下5 h活性艳蓝KN-R在脱色率能达70%以上．