血清白蛋白和球蛋白的分析测定－盐析法

【目的与原理]】

掌握血清白蛋白和球蛋白测定的原理和方法，并用盐析法测定水产动物血清中白蛋白和球蛋白的含量。

血清中含有多种不同成分的蛋白质，主要为白蛋白和球蛋白。用盐析法沉淀血清中球蛋白，用双缩脲法测定上清液中白蛋白，同时测定血清总蛋白。血清球蛋白的量从两者的差值求得。

【[试剂与器材】

试剂：
　　1、球蛋白沉淀剂：称取硫酸钠（Na2SO4）208g，及亚硫酸钠（Na2SO3）70g，加入蒸馏水约900ml，并加入浓硫酸2ml，使蒸馏水酸化。不停搅拌，待完全溶解后将溶液移入1L容量瓶内，用蒸馏水稀释至1L刻度。保存于25℃以上的温度中。

　　2、双缩脲试剂

　　3、标准血清：市售或配制。

　　4、乙醚

器材：
　　可见分光光度计，离心机，试管若干及试管架，旋涡混合器，塑料试剂瓶，1L容量瓶，烧杯2个，吸管若干支，滤纸，擦镜纸。

【实验步骤】

1、准确吸取血清样本0.2ml，置于10×100mm试管内。以5ml刻度吸管加入球蛋白沉淀剂3.8ml，塞住管口，反复倒转混和10次（不宜过多）。以1ml刻度吸管吸取悬液1ml（相当于血清0.05ml），置于另一试管内，作为“总蛋白测定管”。剩余的混悬液另加乙醚约2ml，揿住管口，在约20秒钟内颠倒混和40次，然后经每分钟2500转的速度离心沉淀5分钟。此时试管内分成三层：上层为乙醚，中层为球蛋白，下层为澄清的白蛋白溶液。将试管斜置在桌面片刻或轻击试管，待蛋白块自管壁分离后，将1ml吸管插入白蛋白溶液中并吸取此溶液1ml（小心，准确，且不可触及球蛋白块片）。取出吸管，用滤纸拭去管尖可能附着的球蛋白沉淀，将白蛋白溶液加入另一试管内，作为“白蛋白测定管”。在另一试管内加入标准血清0.2ml及球蛋白沉淀剂3.8ml，混和后准确吸取混悬液1ml，加入一试管中作为“标准管”。再取一试管加球蛋白沉淀1ml，作为“空白管”。

2、每管中各加入双缩脲试剂4毫升，充分混和后置室温暗处30分钟，用540nm或绿色滤光片进行比色，以空白管校正光密度到0点，读取各管光密度读数。

3、计算
　　将所测得的光密度读数按下列公式计算出白、球蛋白含量及其比值：
　　（1）总蛋白测定管光密度/ 标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清总蛋白g/100ml
　　（2）白蛋白测定管光密度/标准管光密度×标准血清蛋白浓度（g/100ml）=血清白蛋白g/100ml
　　（3）血清总蛋白—血清白蛋白=血清球蛋白g/100ml
　　（4）血清白蛋白÷血清球蛋白=血清白蛋白、球蛋白比值（A/G）

4、标准曲线绘制：同血清（浆）总蛋白测定双缩脲法
　　但用球蛋白沉淀剂代替生理盐水作为标准血清的稀释剂。

【方法评估】

本方法采用盐析法定量测定白蛋白和球蛋白的，用硫酸钠和亚硫酸钠分离血清白、球蛋白，所得结果与电泳法相符合。但由于盐类浓度较高，操作需在较高的温度下进行，否则将有结晶析出。在25℃操作时，无结晶析出。用亚硫酸钠作为沉淀剂除可在较低的温度操作外，还有另一个优点，即它具有缓冲作用。亚硫酸钠溶液呈碱性，其pH值高于所有血清蛋白的等电点，使各蛋白质均带有相同的电荷，这将有利于它们的分离。血清经盐析分离后，蛋白质的测定一般均用比色法。

【应用意义】

白蛋白和球蛋白的量是按鱼种不同而有所变化，一些鱼白蛋白>球蛋白，另一些鱼白蛋白<球蛋白，白蛋白与球蛋白的成分按性别、年龄、成长、季节的变化，营养不良、饥饿、应激刺激等所发生变化。

【注意事项】

1、某些用乙醚及离心沉淀不易得到白蛋白澄清液的标本，在加入球蛋白沉淀剂后，可不加乙醚，而用优质小张中速滤纸在37℃水浴箱中反复过滤多次，最后可获得澄清液作白蛋白测定，必要时可按1：20比例扩大血清及球蛋白沉淀剂用量。

2、本法测定结果与电泳法相符合，但操作须在25℃以上的室温中进行。如受实验室条件限制，只能在较低的温度下进行测定时，可改用盐浓度较低的球蛋白沉淀剂（其它试剂及操作方法均与本法相同），但测定结果白蛋白值较本法略高。常用的低浓度球蛋白沉淀剂为23%硫酸钠溶液（无水硫酸钠230g，加蒸馏水至1L）或21%亚硫酸钠溶液（无水亚硫酸钠210g，加蒸馏水到1L）。