衣藻的遗传技术(转化)实验

细胞

EcoRI 酶

SGII 培养基

1. 500 ml 烧瓶中装 250 ml SGII 培养基，在通气和恒定光照条件下，培养细胞至 5X10⁶ /ml 密度。

2. 用 EcoRI 酶切质粒。

3. 去细胞壁，低速离心浓缩细胞，在 SGII-NO₃ 培养基重悬细胞为 10⁹ 个/ml。

4. 将细胞放入灭菌烧瓶中，刚好盖上瓶底，在亮光下轻摇 4 个小时。

5. 转化时，将细胞稀释到 1.7X10⁸ 个/ml，取 0.3 ml 加入装有 0.3 g 玻璃珠的 15 ml 带塑料帽的圆锥形离心试管中。

6. 加入灭菌 PEG 溶液，终浓度为 5%。

7. 立即加入 1 μg 线性化的 pMN24 DNA，用旋转混合仪最高速度旋转混合 45 秒。

8. 立即加入 10 ml SGII-NO₃ 培养基稀释交配混合液，将细胞倒入一干净的 15 ml 试管中，用桌面医用离心机沉淀离心。

9. 留 0.3 ml 培养基，重悬细胞，涂布在 SGII-NO₃ 培养基的 1% 琼脂平板上。

10. 平板放在恒定的光照下孵育 5~8 天。

11. 通常转化后孵育 8 天，克隆可用肉眼观察到时，用灭菌牙签将单个克隆转到多孔皿上含少量 SGII-NO₃ 培养基的单个孔中过夜培养。

12. 在选择培养基平板上划线，分离转化的纯克隆。