表达蛋白检测实验_点印迹法

抗外源蛋白抗体细胞悬液

PBS／Tween（含和不含 BSA）

[125I] 标记的蛋白 A离心管离心机1 ml 注射器的活塞点迹仪硝酸纤维素膜24 孔培养板

1. 病毒感染细胞并完成筛选（见「痘苗DNA检测实验」中「PCR 法」步骤 1~9）。

2. 轻轻刮下细胞，转移到离心管中，最大转速离心 30 s，弃培养基，用 200 μl PBS 重悬。24 孔培养板中的细胞也可用 1 ml 的注射器的活塞刮取。

3. 冻融并超声细胞悬液（见「痘苗DNA检测实验」中「PCR 法」步骤 11、12）。

4. 将硝酸纤维素膜剪至适合点迹仪大小，将其用水浸湿，放入仪器中，每孔中加入 20~100 μl 的细胞悬液（步骤 3），用抽吸的方法使液体流过硝酸纤维素膜，随后将膜取出。

5. 用含 4% BSA 的 PBS/Tween 浸润硝酸纤维素膜 30 min，用不含 BSA 的 PBS/ Tween 洗 1 次。

6. 将外源蛋白抗体用最小体积的 PBS/Tween 以 1:50～1:5000 稀释，与膜室温孵育 ≥ 1 h。

7. 用大体积 PBS/Tween 清洗膜 5 次。

8. 用含有 1 μCi/ml [ ¹²⁵I ] 标记的蛋白 A 的最小体积 PBS/Tween 与硝酸纤维素膜孵育 30 min。此外，化学发光检测系统（如 Amersham ECL）也可检测抗体。

9. 用大体积 PBS/Tween 清洗膜 5 次。

10. 用塑料薄膜将硝酸纤维素膜包好，X 射线胶片放射自显影。

1. 所有培养都在加湿的 37℃ 5% CO₂ 培养箱中培养，除非有特殊说明。

2. 与活细胞接触的器械和试剂都应该是无菌的，操作也必须无菌。

3. 除用重组蛋白抗体替换抗痘苗病毒抗体之外，可用「鸡胚成纤维细胞制备实验」、「MVA病毒储液制备实验」介绍的免疫染色法对含有噬斑的感染细胞进行原位染色。