解密神经元：脑连接图谱走向单细胞精度时代

稀疏标记系统工作原理

15个多巴胺神经元的全脑投射形态重构

　　就像广袤无垠的宇宙中有无数星体，人类大脑中分布着千亿数量的神经元，它们“杂乱无章”地分布且相互连接，发挥着感受刺激和传导兴奋的作用。这些决定人类思考能力的大脑神经元究竟是怎么连接的？这个问题自神经生物学兴起以来一直悬而未解。

　　过去，神经生物学家们已经描绘了大脑中不同脑区之间以及不同位置神经元类群之间的连接，但尚未认识到单个细胞精度下的连接方式，这阻碍了对神经系统的精细认识以及一些疾病的精准治疗。

　　近日，北京生命科学研究所教授罗敏敏团队以及华中科技大学教授龚辉团队合作，完整重构了全脑范围内单神经元连接图谱，并获得了高精度的全脑成像。相关成果发表在《自然-方法》上。

　　从“一团”到单个

　　大脑中的神经元呈“抱团取暖”状，且“团”的规模稀疏有别，将它们相互连接的是轴突，如电线般又密又细且互相“缠绕”。

　　“要想清晰分辨单神经元的结构，理清哪条‘线’连接哪两个神经元，需要对神经元进行稀疏且高亮地标记。”罗敏敏告诉《中国科学报》记者。

　　最早的稀疏标记方法是诸如高尔基染色法等的化学法，一直沿用至今，这些方法使人们认识了大脑存在大量且种类不同的神经元。但其缺点在于“一染一大片”，不具有选择性，无法获知不同神经元在基因、蛋白等方面的区别。

　　近年来，“玻璃电极”标记法逐渐兴起，想要研究某个细胞，就将电极插入该细胞内，注射染料进行标记，但该方法只能“看到一个标记一个”，难以操作且效率低。

　　此外，根据已有的标记方法，科学家们可清楚看到某个脑区神经元细胞“团”的轴突大概伸出的方向，但问题在于每个“团”里还存在着大量不一样的神经元，它们轴突的特征不清楚。

　　“传统标记方法呈现的图谱很粗糙”，论文第一作者、北京生命科学研究所博士林睿形象地举了个例子，“就像我们知道可以开车从北京A地到B地，但实际上两地之间有许多不同的路，有的远，有的近。”

　　为何要执着于描绘单细胞精度的连接？林睿同样以路类比，“从A地到B地，整体上看不堵车，但实际有些路非常堵。同样地，在进行神经退行性疾病检测时，大范围看，1万个神经元细胞好像没什么问题，但其中的100个细胞很可能已经有早期的病变现象，而传统方法无法捕捉到这些信息。”

　　林睿还提到，目前神经生物学研究大多通过大脑切片的方式，只能看到单个神经元细胞的部分形态而非全貌，解决该问题还需要高精度高通量的自动化光学成像系统来获得全脑成像，从而进行神经元细胞的完整重构。

　　特异性标记：“指哪打哪”

　　在对神经元的研究中，稀疏特异性标记与高亮度成像两者同时实现，一直是难以跨越的“鸿沟”。

　　“特异性选择是为获得我们感兴趣的神经元细胞，它们对某些行为或病理有某些特定的功能，而高亮成像是为了在光学显微镜下更清晰地看到轴突延伸的方向以及长度”，林睿说。

　　为解决这一矛盾，研究人员引入了两个腺相关病毒（AAV），一个名为“控制子（Controller）”，负责控制降低标记细胞的个数；另一个名为“放大子（Amplifier）”，负责增加标记亮度。将两个病毒混合后注射到小鼠脑内感兴趣的细胞上，混合病毒便会侵染神经元，进行特异性标记。通过调整“控制子”和“放大子”的混合比例，控制标记的稀疏程度。

　　利用基于两个腺相关病毒的稀疏标记系统，罗敏敏课题组与华中科技大学国家光电研究中心fMOST课题组合作，借助其荧光显微光学切片断层扫描平台，建立了“细胞特异性稀疏标记—高分辨率全脑形象-神经元形态学重建-量化分析”的流水线，实现稳定高通量的全脑成像和图像分析。

　　在这一流水线上，研究人员在3个DAT-Cre小鼠中重构了15个中脑多巴胺神经元的完整形态。经分析，研究人员认为重构的多巴胺神经元有两种投射模式：其中10个多巴胺神经元轴突只有单个投射目标，它们在终点处会形成小而密集的末端树状分支；另外5个则分布更为广泛，会有多个分支投向不同目标。

　　共享开放的平台

　　“大脑是复杂的，神经生物学的研究越来越细化。这项研究让我们对单个神经元细胞的特异性信息有了一个更清晰的认识。”他们在研究中专门考虑到标记方法的兼容性，使用了转基因小鼠，这适用于几乎所有大脑区域的大多数主要细胞类型。

　　这样做的好处在于，如果其他研究人员想用这个方法，用他们感兴趣的转基因小鼠，直接用这两个病毒来标记他们想要研究的神经元即可。

　　罗敏敏告诉记者，不同研究人员可利用这个方法对小鼠的各个脑区不同神经元进行普查，建立单细胞精细结构基础数据库，“这样，我们可以了解帕金森、阿兹海默等病症发病的早中晚期在单个细胞形态上的变化。”

　　未来，他们期望这一稀疏标记系统被更多感兴趣的研究者所使用，“大脑神经元太多了，不是我们重构一、两千个就够了，需要更多的人来做，同时结合算法把数据处理的效率提上去。”林睿说。