试管凝集试验

实验概要

颗粒性抗原与相应抗体直接结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集现象。试管法是用定量抗原悬液与一系列倍比稀释的待检病人血清混合，置37℃过夜静止。根据每管内颗粒抗原凝集的程度，以判断待检血清中有无相应抗体及其效价。是一种半定量试验。

主要试剂

1．诊断菌液：生物制品所有商品供应，包括伤寒沙门氏菌H或O菌液（所受诊断菌液多为70亿／ml菌体，用前须按使用说明分别以0.9％生理盐水稀释至适当浓度，一般为10亿菌体／ml）。

2．待检血清：可以不加温灭能，用生理盐水做1：10稀释。

3．生理盐水：0.9％的生理盐水。

主要设备

小试管，试管架，刻度吸管，恒温水浴箱等。

实验步骤

操作方法

1．排管并做标记：准备小试管8支，排列于试管架上，标明序号。

2．每管内加入生理盐水0.5 ml。

3．稀释被检血清: 具体操作见表1.1

     ①吸取1:10待检血清0.5ml加入第一管中，充分混匀，使血清稀释成1:20。

     ②吸取上述1:20血清稀释液0.5ml，放入第2管中，充分混匀，使血清稀释成1:40。

     ③吸取上述1:40血清稀释液0.5ml，放入第3管中，充分混匀，使血清稀释成1:80。

     ④如此连续稀释到第7管为止。

     ⑤第8管只加生理盐水0.5ml，不加血清，作为生理盐水对照。

     ⑥稀释后，第1至第7管的血清稀释度依次为1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280。

 4．加入诊断菌液: 将诊断菌液分别加于每一试验管及生理盐水对照管，每管0.5ml。此时各排第1管至第7管的血清因加入等量菌液而又稀释一倍。

 5．血清最后稀释度: 1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1：2560。

 6．振摇混匀、保温: 将所有试管振摇、混匀后，置37℃温箱或水浴过夜（或56℃2～4小时）以促进反应。

      表1•1                                                                  

                单位（ml）         1        2          3          4            5           6             7              8     

             0.9%生理盐水      0.5    0.5       0.5       0.5        0.5        0.5          0.5           0.5

             1:10待检血清       0.5     0.5      0.5        0.5        0.5        0.5          0.5         弃0.5

              血清稀释度        1:20   1:40    1:80    1:160   1:320    1:640     1:1280       ——  

                TO(或TH)           0.5      0.5      0.5        0.5       0.5        0.5          0.5           0.5  

           最后血清稀释度   1:40    1:80    1:160   1:320   1:640   1:1280   1:2560      阴性对照 

    *注:此种稀释法为免疫学试验中常用的“连续倍比稀释法”。

结果观察

1．观察条件：有良好的光源和黑暗的背景

2．取出试管: 从温箱或水浴箱中轻轻取出试管架，不要摇动试管。

3．观察方法: 把试管举起以观察试管内的上清液浊度和管底凝集物，然后再轻摇试管，使凝集块从管底升起（注意观察凝集物的松软程度、大小、
       均匀度等性状）。最后按液体的清浊、凝块的性状记录结果。

4．观察顺序：应先看盐水对照管（8号管），此管应呈阴性，即不凝集（详见结果记录）。然后由1号管至7号管依次观察。

结果记录

1．      很强，上清液完全透明，细菌全部形成凝块，沉于管底。

2．       强，上清液透明度达75％（微混），大部分细菌形成凝块，沉于管底。

3．        中等强，上清液透明度达50％（较混浊），约50％细菌形成凝块。

4．         弱，上清液透明度只达25％（混浊），仅有小部分细菌形成凝集。

5．    -     不凝集，液体均匀混浊，无凝集。轻轻摇动试管，细菌分散。

效价判定

1．一般以出现“ ”凝集的血清最高稀释倍数作为该血清的凝集效价。

2．分别报告被检血清对伤寒沙门菌H抗原（可用TH表示）或伤寒沙门菌O抗原（可用TO表示）的凝集效价。

3．若第一管仍无凝集现象应报＜1: 40。

4．若第7管仍呈“ ”或更强凝集现象应报＞1:2560。

临床意义

        本法主要用于检查血清中有无某种特异性抗原及其含量（效价）。以协助临床诊断或供流行病学调查研究。例如：诊断伤寒和副伤寒的Widal reaction、诊断斑疹伤寒和恙虫病等立克次体病的Weil-Felix reaction、诊断布氏菌病的Wright reaction。这些试验对相应疾病的诊断具有一定的决定作用。

注意事项

1．抗原抗体比例必须适当，才能出现肉眼可见的反应。如果抗体浓度过高，会出现前带现象，要对抗体进一步稀释，需要与阴性加以鉴别。

2．判断结果时，应在暗背景下透过强光逐管检查。

3．液体混合：将两种液体混合时，需用吸管连续吸取数次。吸液时吸管应深入液面下，以防吸进空气。注液时应离开液面，以防产生气泡或使液面溢出试管。

      注意温度、PH值、电解质、振摇对试验结果的影响。水浴箱的水面不要高出试管内液面，以利于试管内液体的对流，增加抗原与抗体的接触。在放入水浴前振摇，可使抗原抗体充分混匀，增加抗原抗体的接触。