详解单克隆抗体的制备过程

单克隆技术又名杂交瘤技术。由G.KÖhler和Milstein1975年创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞，生产抗体。

单克隆抗体的制备过程主要有以下六个环节，具体为抗原指标、免疫动物选择、免疫程序的确定、免疫、细胞杂交与选择培养。

下面详细介绍单克隆抗体制备过程每一步的做法。

1、抗原制备 

  制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。    

2、免疫动物的选择 

  根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。 

3、免疫程序的确定

  在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在后一次加强免疫后第3天取脾融合为好， 

注：体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此，针对这些情况，可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。

4、 免疫前的准备

佐剂是非特异性免疫增强剂，与抗原一起注射或预先注射入机体内时，可增强机体对抗原的免疫应答。

5、免疫         

用佐剂和抗原按照1:1的比例进行混合，混合后进行磨合。磨合可以使用玻璃针管反复推拉，至佐剂抗原滴入水中既不会产生大面积油花，也不会分层。取一定量佐剂抗原对免疫动物进行分段多次注射。

注意：在注射的时候要小心，不要感染免疫动物。                                

6、细胞杂交与选择培养

（1）杂交筛选：细胞杂交之前，要分别准备好脾脏的B细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞。免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎，将B细胞悬浮在没有血清的培养液中并洗涤3次去掉小鼠的血清。细胞用培养液洗涤2-3次，把两种细胞合并在同—试管中，用50%的聚乙二醇作为融合剂，在37℃条件下融合1-2min。用培养液缓慢稀释，除去PEG，将存活细胞分散至HAT选择培养板中。融合后的细胞在培养皿上用HAT培养液(培养液中含10%-20%胎牛或小牛血清和HAT)在37℃，5%CO2进行培养。形成可用的细胞克隆后经过几次更换培养液后进行抗体活性检测（见抗体检测）。分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养，检测每孔细胞是否产生所注射抗原的抗体。

注意：在细胞融合后选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活，通常需要加入饲养细胞使之繁殖。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。

（2）细胞培养：将筛选出来的细胞直接注射到小鼠的腹部，培养3-4天。吸取培养好小鼠的腹水，将抽取的腹水进行梯度离心就可以分离到纯净的单克隆抗体。

注意：细胞也可以在体外进行培养，不过体外培养对环境要求，很容易就感染了菌株从而造成整个实验的失败。在抽取腹水的时候不要多次抽取，尽量一次抽取成功，否则很容易感染菌株。

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