诱变物质的微核测定实验

实验方法原理：微核（micronuclei)简称（MCN）是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的。在细胞间期，微核呈圆形，游离于主核之外，大小应在主核1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有伍万DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒断片产生的。研究工作证实：整条染色体或好几条也能形成微核。这些断片或染色体在比细胞分裂未期被两个子细胞核所排斥便形成了第三个核块。已经证实微核率的大小是和用药的剂量或辐射累积效应呈正相关，这一点和染色体畸变的情况是一样的。所以许多人认为可用简易的间期微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样的工业废物的排出，使人们需要有一套高度灵敏，技术简单的测试系统来监视环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。在这方面，微核测试是一种比较理想的方法。目前国内外不少部门已把“微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面。

现有的微核测试系统多数是用哺乳动物的骨髓细胞或外周血细胞，其缺点是需要一定的培养条件与时间，且细胞同步化困难，微核率低，一般只在0.2%左右。近年来，有人采用高等植物花粉孢子，利用天然的同步性作微核测试材料。取得良好的效果。其中马德修用一种原产于美洲的鸭跖草（Tradescantia paludosa）,建立四分孢子期微核率计数（MCN-in-Tetrad）的测试系统，是近年来普遍认为较好系统之一。该系统用低剂量的化学药物处理或辐射处理，其微核率可达10%-67%。

本实验改用简单易行的烟草种子进行发芽，用一定浓度的盐酸平阳霉素进行处理，以计微核的诱变率。

实验材料：烟草种子  

试剂、试剂盒：

盐酸平阳霉素                                                                 

固定液 

仪器、耗材：

三角瓶                                                                  

剪刀                                                                  

镊子                                                                  

载玻片                                                                 

盖玻片 

实验步骤：

一、实验材料

将烟草种子用40℃温水中浸泡40分钟，用布包住种子轻轻撮，之后，置具有吸水纸的培养皿中于25-28℃下催芽，大约三天左右，待幼根长到2-4mm左右，将萌芽的种子置入一定浓度的盐酸平阳霉素中进行诱变5-8小时，用清水冲洗三到五遍，再培养过夜后，用固定液固定待用。

二、实验器具和药品

1、盐酸平阳霉素，配制20m g/ml、40 m g/ml、80 m g/ml浓度的溶液

2、固定液：3甲醇：1冰醋酸

3、染色液

4、实验用具：三角瓶，剪刀，镊子，载玻片，盖玻片等

三、实验说明

处在分裂时期的细胞，对理化因素的处理是有一定敏感时期的。烟草糼根在17：00-24：00对平阳霉素的处理较为敏感。处理过程中所产生的落后染色体或落后染色体组也能在中期染色体中表现。

四、实验步骤

1、将烟草种子用40℃温水中浸泡40分钟，用布包住种子轻轻撮，之后，置具有吸水纸的培养皿中于25-28℃下催芽（或置入盛有蒸馏水的三角瓶中25-28℃振荡培养），大约2-3天左右，待幼根长到2-4mm左右。

2、将萌芽的种子分别置入20m g/ml、40 m g/ml、80 m g/ml浓度的盐酸平阳霉素中进行诱变5-8小时，用清水冲洗三到五遍，再培养过夜后，用固定液固定待用。

3、、挑取适当经诱变后的幼根，换以70%，50%，30%酒精中各10分钟，蒸馏水冲洗两次。

4、60℃1NHCL中3-5分钟，再放入1N冷HCL中1分钟，取出用清水稍微冲洗后，置载玻片上，滴少量染色液，盖上盖玻片，轻轻敲打，使根尖细胞分散，置显微镜下观察。

5、对照以下图片说明，比较所观察到的结果。

图片说明：1，微核，; 2 小核，；3，双核，；4，核出芽；5，核缢缩；6，核耳；

7，桥+落后染色体；8，桥+染色体断片；9双桥；10，多桥；11游离染色体，

12染色体粘连；   注：以上图片为   X 200