诱饵蛋白特性鉴定实验

蛋白质

CM培养基

水浴锅 培养箱 电转仪

一、lacZ激活试验

1.  采用标准的亚克隆技术，将编码目的蛋白质的DNA插入pEG202的多接头中，构建一个符合读框的融合蛋白。

2.  将下列组合的质粒，分别按“乙酸锂转化法”转化酵母菌EGY48。

（1）pBait+pSH18-34（实验组）

（2）pSH17-4+pSH18-34（激活阳性对照组）

（3）pRFHM1+pSH18-34（激活阴性对照组）

3.  将转化混合物涂布于Glc/CM-Ura-His 省却成分培养基平板，于30℃培养过夜，选择含两种质粒的酵母菌。

4.  将上步获得的三种转化子（实验组，阳性对照和阴性对照组）分别各挑至少5或6个单菌落，并将毎个克隆划在一个Glc/CM-Ura-His 省却成分培养基的主平板上。 

5.  将一块尼龙膜轻轻地放在含酵母菌的平板上，待其完全浸湿后取出，尼龙膜在空气中干燥5 min，将沾有菌落的一面朝上，于-70℃冷冻10 min。

6.  取一张浸泡在含1 mg/ml Xgal的1×Z缓冲液中的Whatman 3MM 滤纸，将尼龙膜置于其上，菌落面朝上。或者直接将尼龙膜放在盛有约2 ml 含1 mg/ml Xgal 的Z缓冲液的培养血中，于30℃温育并现察克隆的颜色变化。

二、抑制试验

7.  将以下组合的质粒分别转化酵母菌EGY48

（1）pBait+pJK101（实验组）

（2）pRS423+pJK101（抑制试验阴性对照组）

（3）pRFHM1+pJK101（抑制试验阳性对照组）

8.  将每一种转化混合物涂布于Glc/CM-Ura-His 省却成分培养基平板上，以便选择具有一对转化质粒的酵母菌细胞，于30℃培养直至菌落出现，通常需要2~3天，但不能超过4天。
 

图一、pEG202 LexA-融合质粒

9.  转化后生长出来的单菌落划线在Glc/CM-Ura-His 省却成分培养基平板上，并于30℃培养过夜。

10.  通过液体检测试验（使用Gal/CM 省却成分培养基），复印膜分析，或结合两种检测方法。检测3组转化酵母菌株中的β-半乳糖苷酸活性（实验组，阳性对照组，阳性对照组）。

三、LEU 2 试验

11.  取一个转化pBait和pSH18-34报道质粒的EGY48酵母菌单菌落，分散于500 μl 无菌水中，取出其中100 μl 稀释在1 ml 无菌水，并用无菌水作1/10倍比连续稀释至1 000倍。

12.  从每一个稀释浓度各取100 μl 分别涂布Glc/CM-Ura-His 省却成分培养基平板和Glc/CM-Ura-His-Leu 省却成分培养基平板，于30℃培养过夜。

13.  选择能作为相互作用阱进行文库选择的克隆；合适的pBaits 应不能激活lacZ 和leuZ 报道基因，要求产生的β-半乳糖苷酶活性比JK101+pRS423 低，与JK101+RFHM1 相当。pBaits 具有较低的激活活性可能也适用的，如pBaits 具很强的激活活性，应该加以截短。