谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的表达及纯化实验

大肠杆菌

氨苄青霉素 LB PBS SDS 甘油 谷胱甘肽

离心机 摇床 转子 超声波发生器

1.  按正确读框将DNA片段亚克隆入合适的pGEX载体中，转化大肠杆菌感受态细胞， 在LB/氨苄青霉素平皿上筛选转化子，以不插入外源DNA的自连载体作对照，平皿置37℃孵育12~15 h。

2.  挑取转化菌落接种于2 ml LB/氨苄青霉素培养基，并在氨苄青霉素主平板上划线培养。同时接种含母本pGEX载体的转化菌作对照。将主平板于37℃下温育12~15 h。液体培养物则于37℃摇床中振荡培养，直至混浊。

3.  加入100 mmol/l IPTG至终浓度0.1 mmol/l 诱导融合蛋白表达，继续保温培养1~ 2 h。

4.  将液体培养物移入一个作好标记的微量离心管中，室温下以最高速度离心5 s，弃上清，沉淀用300 μl 冰浴预冷的PBS液重悬。取10 μl 入另一个作好标记的离心管中 。

5.  用带直径2 mm 探头的超声波发生器破碎细胞，4℃下高速离心5 min，除去不溶性物质， 将上清移入一新的离心管中。

6.  毎管上清加50 μl 50%谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液，室温下轻柔混匀，加1 ml PBS用旋涡混合器短暂振荡旋起，高速离心5 s，收集琼脂糖珠，弃去上清，重复用PBS洗涤2次。

7.  往冼过的琼脂糖珠中加等体积的1×SDS样品缓冲液，另加入30 μl 于10 μl 的全细胞 重悬液中，100℃加热3 min，用旋涡混合器短暂振荡旋起后，加样于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，电泳适当时间，用考马斯亮蓝染色使GST蛋白和融合蛋白显迹。

8.  挑取一个pGEX转化菌落接种于100 ml LB/氨苄青霉素培养基中，在37℃摇床中培养12~15 h。

9.  以1：10比例将此培养物稀释于1 L 新鲜的LB/氨苄青霉素培养基中，分入两个2 L 的瓶中，37℃下培养1 h。

10.  加100 mmol/l IPTG至终浓度0.1 mmol/l，继续培养3~7 h。

11.  室温下5 000 g 离心10 min，收集细胞，弃上清。沉淀重悬于10~20 ml 冰浴预冷的PBS中。

12.  将离心管置于冰浴，用带直径5 mm 探头的超声波发生器裂解细胞，调整频率和强度避免产生泡沫，伹使裂解于30 s 内完成。 

13.  加入10%的Triton X-100至浓度为1%并混匀。室温下10 000 g 离心5 min 除去不溶性成份和未裂解的细胞。或取1.5 ml 一份的样品，4℃以微量离心机在最大速度离心5 min，收集上清（小心避免吸入沉淀）。

14.  上清加入1 ml 50%的谷胱甘肽-琼脂糖珠混悬液中，室温下轻柔混匀≥2 min。加50 ml 冰浴预冷的PBS液洗涤、混匀，在台式离心机上500 g 离心10 s。重复洗涤2次，用少量（1~2 ml）冰冷的PBS重悬琼腊糖珠，并移入一个1. 5 ml 微量离心管中。
 

15.  室温下500 g 离心10 s，收集琼脂糖珠，弃上清。加1 ml 50 mmol/l Tris·Cl（pH8.0）/5 mmol/l 还原型谷胱甘肽冼脱融合蛋白。轻柔混匀2 min，500 g 离心10 s，收集上清， 重复冼脱2~3次，经SDS-PAGE分析各分部收集的样品。洗脱的蛋白质分成小份，加甘油10%贮存于-70℃。测量280 nm 下的吸光度确定融合蛋白产量，对GST载体来说，A₂₈₀=1相当于蛋白质浓度为0.5 mg/ml。