质粒的制备

实验方法原理 在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

实验材料 pUC18大肠杆菌

试剂、试剂盒 LA培养基异丙醇水乙醇

仪器、耗材 无菌牙签移液枪震荡器Eppendorf管离心机超净台

实验步骤

1.   取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37 ℃过夜培养；

2.   用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37 ℃摇床~250 r/min过夜培养；

3.   吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；

4.  溶液m4. 加入300 μI振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）； 

5.   加入300 μI溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；

6.   加入300 μI溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；

7.   12000 g离心10分钟；

8.   吸取800 μI上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；

9.   12000 g 常温离心15分钟；

10.   倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；

11.   室温放置或超净台上风干DNA；

12.  加40 μI灭菌超纯水或TE溶解；

13.   质粒、BAC的质量检测，于-20 ℃保存。