质粒载体和外源DNA的连接反应

实验概要

掌握DNA体外连接的基本技能，了解连接反应的注意事项。

实验原理

DNA片段之间的连接是通过DNA连接酶的催化实现的。DNA连接酶催化具有平末端或互补粘性末端的DNA片段间相邻碱基通过3’,5’磷酸二酯键连接起来，该反为需能反应，通常需要加入ATP或NADH，DNA连接酶对粘性末端的连接效率要远高于对平末端的连接效率。在基因基因工程实验中，最常用的来源于T4噬菌体的T4DNA连接酶。对于平末端或互补的粘性末端可直接进行连接反应。一个片段是平末端，另一片段为粘性末端或两个片段都是粘性末端但不配对，则需要通过各种方式使其可一匹配或通过平末端进行连接。通常采用末端补平、加同聚物尾、加接头等方式是目的片段之间能够匹配。
 

进行连接反应时，为了减少片段的自连，通常要进行去磷酸化，去磷酸化可通过碱性磷酸酶完成。比如将目的片段和载体进行时通常要将载体去磷酸化，以减少载体的自连。同要进行连接反应也经常对目的片段进行磷酸化以增强目的片段的连接，在相邻碱基间如果没有磷酸在连接效率大幅下将，如果载体进行了去磷酸化，目的片段可进行磷酸化，以增强目的片段和载体的连接。
 

在连接反应中，目的DNA片段和载体的比例是一个关键问题，对于长度为1kb的片段和3kb的载体而言，通常目的片段和载体的比例设为2：1或3：1，如果目的片段越长该比例应再升高，因为主要考虑的是载体和目的片段之间的分子数的比例。反应体系中核酸的浓度也是一个重要问题，通常反应体系中反应物浓度应保持在25-100 ng / μl。
 

连接反应和其它酶不同，需要在较低的温度下进行，通常在12～16℃过夜，也可在4℃过夜连接，如果是平末端连接，可适当提高连接温度。除上述因素外，DNA样品的纯度、盐浓度等会影响连接效率。

主要试剂

1、目标DNA片段（实验九RT-PCR扩增产物）

2、载体（pGEMT-easy）

3、2 × ligation 缓冲液

4、T4 DNA连接酶

5、ddH2O

主要设备

1、台式离心机

2、恒温水浴

3、微量移液器

实验步骤

1、取一个1.5ml离心管依次加入下列试剂:
 

2 × buffer：               5μl

pGEMT-easy：    0.5μl

目的片段：               2.5μl

T4连接酶：                1μl

ddH2O                       1μl

2、2000 rpm 离心30S，使反应体系充分混合。

3、4℃过夜连接。