质粒DNA的大量制备实验

培养基 菌株

EDTA SDS 乙醇 乙酸钾 异丙醇

离心管

1.  往5 ml的含选择性试剂（通常是氨苄青霉素）的LB培养基或丰富培养基接种单菌落。于37°C剧烈振荡培养过夜。

2.  往2 L烧瓶中加入500 ml含有适当抗生素的LB培养基，然后加人1 ml过夜培养的大肠杆菌培养物，再于37°C培养至饱和状态（OD₆₀₀≈4）。
 

3.  于 4°C，6000 g 离心 10 min。

4.  用4 ml GTE溶液重悬沉淀，并转移到一个容积≥20 ml的高速离心管中。

5.  加入1 ml新配的含25 mg/ml溶菌酶的GTE溶液（终浓度5 mg/ml），彻底重悬沉淀，于室温放置10 min。

6.  加人10 ml新配的NaOH/SDS溶液，并且轻轻混匀直至液体变得均一、清亮而黏稠。于冰上放置10 min。

7.  加人7.5 ml 3 mol/L乙酸钾溶液，用吸管轻轻搅拌直至黏稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置10 min。

8.  于4 °C，20000 g离心10 min，将上清轻轻倒人至另一个干净的离心管中，如果有可见的漂浮物可用数层纱布过滤。

9.  加人0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5~10 min。

10.  室温，15000 g离心10 min。弃上清，加人2 ml 70%乙醇轻轻洗涤沉淀。

11.  室温，15000 g短暂快速离心，吸去乙醇，并真空干燥。4 °C无限期保存。

1.  为提髙产量，应采用表面积较大及带折流板的烧瓶以尽量增大通气度；振摇速度大于400 r/min。

2.  如果DNA要用层析法纯化，加人50 μg/ml RNA酶A以降解RNA。