质粒DNA电泳鉴定

1．目的

学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳。

2．原理

DNA双螺旋分子骨架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。

3．器材

电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250ml三角瓶，微波炉，台式离心机，旋涡混合器，凝胶成像系统，分光光度计，微量移液取样器，1.5ml离心管，双面微量离心管架，试管架等。

4．试剂

pET-his质粒，pMD18-T-NK载体，TAE电泳缓冲液，1000×溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉，10×加样缓冲液（或6×加样缓冲液），DNA分子量标准（λDNA HindIII: 23130，9420，6560，4360，2320，2030，560，130 bp）。

5．实验准备

配制TAE电泳缓冲液（50×储存液，pH约8.5：Tris碱 242g，57.1ml冰乙酸，37.2g Na2EDTA.2H2O，dd water 定容至1L），1000×溴化乙锭储存液（0.5mg/ml：50mg溴化乙锭溶于100mL dd water，4°C避光储存），10×加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；6×加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。

6．操作步骤

（1） 称取0.5g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50ml TAE电泳缓冲液(1×)，放入微波炉中烧开（1min）。50ml 正好倒两块小胶。

（2） 注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。

（3） 戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60°C）。

（4） 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。

（5） 在水平电泳槽中加满1×TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。

（6） 待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。

（7） 剪1片光面纸（或封口膜），点6μl蒸馏水、1μl 10×加样缓冲液，再加入3μl质粒DNA溶液制成10μl DNA样品。

（8） 在凝胶上选择相邻的加样孔。用10μl的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3μl DNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。

（9） 打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。

（10） 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。

（11） 把凝胶小心反扣放入盛有EB的搪瓷盒中。放置约10分钟后，取出用自来冲洗两次。放入凝胶成像系统中拍照。

（12） 清理垃圾。染有EB的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。