质粒DNA的限制性酶切及电泳分析

原理
限制性核酸内切酶能特异地识别和切割双链DNA中的碱基顺序，本实验中所用的pBS-SK质粒分子总长约2.9kb，经酶HindⅢ切割后，闭合环状质粒DNA即变成线性DNA分子。
不同大小、不同形状和不同构象的DNA分子在琼脂糖凝胶中有不同的电泳迁移率，因而可通过电泳使其分离。
试剂
1、限制性内切酶HindⅢ
2、10×酶切缓冲液
3、6×上样缓冲液0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青；30％甘油水溶液
4、50×电泳缓冲液
称242g Tris碱，加H2O 800ml，待完全溶解后，加57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)，用H2O定容至1000ml。临用前用H2O稀释成1×电泳缓冲液。
5、琼脂糖
6、溴化乙锭(EB) 10mg/ml：取EB 0.10g完全溶解10ml水中，避光室温保存。
EB有一定毒性，接触含EB的溶液时，务必戴上一次性手套。
7、DNA分子量标准：λDNA/HindⅢ
操作
一、pBS-SK的限制性酶切
1、取实验十四中制备的pBS-SK溶液5μl，10×酶切缓冲液3μl，双蒸水20μl，混匀；
2、加核酸内切酶HindⅢ 2μl (20u/μl)，轻敲管底使内容混匀，置离心机中离心数秒。
3、置37℃水浴中保温1小时后，即可进行电泳分析。
二、质粒DNA酶切片段的电泳分析
1、制胶先将电泳板两端用胶布密封，在距一端约1厘米处插入上样梳齿板，然后将电泳板水平置于实验台上。
称取DNA电泳用琼脂糖0.4g放入100ml三角烧瓶中，加40ml 1×TAE缓冲液，将烧瓶置微波炉或电炉上加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解。待凝胶溶液冷却至60℃左右时，加溴化乙锭(10mg/ml) 2μl，混匀后趁热将凝胶溶液倒入电泳板上。室温下待凝胶完全凝固(约需30分钟)，揭去两端胶布，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中。
2、电泳向电泳槽中加1xTAE缓冲液至刚没过凝胶表面。

取三支Eppendorf管，标号，如下表准备电泳样品。

混匀后，依次全部加入三个点样孔中，注意加样器吸头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。

接通电源，调节电压至5V/cm，电泳1小时后，将凝胶板取出。在紫外灯下观察记录结果。

注：本实验使用的分子量标准为λDNA/HindⅢ，含有7个长度不等的DNA片段：23130bp；

9416bp；6557bp；4361bp；2322bp；2027bp；564bp；125bp。