质谱仪在临床病原菌感染诊断中的应用

质谱（mass spectrometry）分析是一种测量离子荷质比（电荷-质量比）的分析方法，可用来分析同位素成分、有机物构造及元素成分等。质谱仪最早的临床应用主要在于检测一些生物标记物以帮助诊断癌症和遗传疾病等。20世纪80年代，基质辅助激光解析电离（matrix assisted laser desorption ionization, MALDI）技术的发明使得质谱能够检测生物大分子，该发明在2002年荣获诺贝尔奖。此后，以MALDI技术为基础的飞行时间质谱（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）在临床得到了更广泛的应用，尤其是对微生物标本的快速鉴定。

一、质谱鉴定微生物的原理

在应用MALDI-TOF MS时，通常将微生物样本与一种饱和的低分子量无机化合物溶液（称为基质）进行混合加在靶板上，待干后样本与基质共结晶后形成了以基质包裹构架的样本固体沉淀。样本基质结晶体经激光辐射，基质从激光中吸收能量使样品吸附，基质与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，离子在加速电场下获得相同的动能，经高压加速、聚焦后进入飞行时间检测器。根据离子飞行时间的不同进行分析得出离子质荷比（m/z）和离子峰值，形成质量图谱。不同的微生物由于蛋白分子组成有差异而形成具有特异性的图谱，通过软件对数据库的比对进行微生物种或菌株的区分和鉴定。

质谱鉴定方法十分迅速，可以在数分钟内完成微生物鉴定，有研究显示MALDI-TOF MS与传统方法比较降低了实验室成本和出报告的时间，与传统方法所需的数小时相比是一个质的飞跃。此外，质谱操作简便，通量高，可以同时鉴定多个样本。通常质谱数据库是作为仪器的组成部分，由各自公司开发和维护，这一点有别于公共开放数据库。质谱仪数据库的可扩展性对于进一步的鉴定分析非常重要，尤其是菌种间的区分和流行病学研究等。由于不同的平台都是在各自的系统中建立自身的数据库并且发展自身的软件、算法和评分标准，因此不同的质谱系统给出的数字信息不具备可比性。不同的质谱系统的比较要通过对微生物鉴定最终结果的准确程度来实现。

二、临床常用的质谱仪

目前临床常用的用于微生物鉴定的质谱仪包括法国生物梅里埃的Vitek-MS和德国布鲁克公司的Biotyper。Vitek-MS最初来自日本岛津公司推出的一款质谱仪Axima，其微生物数据库SARAMIS由德国Anagnos Tec公司开发。Biotyper系统是布鲁克公司独立研发的产品。两个系统的数据库都是开放平台，支持使用者添加和扩大数据。

MALDI-TOF MS是十分准确的细菌鉴定方法，培养的条件如培养基或者pH值的变化对检测结果的影响很小，所以实验室间可比性也很好。在已发表的大多数研究中，质谱分析出现错误报告的几种原因为，数据库自身不完整、数据比对或者采集时发生错误、质谱分辨率无法区分的相似菌种等。

三、质谱技术在临床感染诊断中的应用

1. 临床常见细菌的鉴定：2009年Seng等用1660株细菌对MALDI-TOF MS常规鉴定细菌进行前瞻性研究，结果显示MALDI-TOF MS是一种经济、快速、准确的常规细菌鉴定方法，未来有可能取代传统的革兰染色和生化方法。此后，MALDI-TOF MS在临床应用迅速增加。在Medline数据库用“MALDI tof bacteria identification”作为MeSH检索词，从2009至2013年1月发表相关文章467篇，其中2011至2013年发表323篇。由此可见MALDI-TOF MS近几年在临床微生物检验中备受关注。

另外，MALDI-TOF MS对弯曲菌、螺杆菌、军团菌等苛氧菌、少见菌等的鉴定，解决了微生物实验室对这类病原菌的鉴定、临床对其感染的诊断和治疗、流行病学资料缺失等的瓶颈问题。

2. 样本直接检测：应用MALDI-TOF MS直接鉴定阳性血培养标本中的细菌和真菌可以极大地提高检测速度。大量的研究尝试用不同的方法来处理血标本，由于血培养基各异、数据库和分析软件等差异都对样本前处理的方法标准化造成了一定的困难。布鲁克公司研发了血培养标本的前处理试剂盒，用于阳性血培养标本直接质谱鉴定的前处理。研究显示革兰阴性菌的准确率优于革兰阳性菌，而对厌氧菌、α-溶血性链球菌和多个细菌混合样本的鉴定存在困难。新的富集技术的应用（比如附加特异性抗体亲和特定蛋白）以及相应分析软件的改进，将使MALDI-TOF MS直接用于血液病原菌的检验成为可能，即MALDI-TOF MS作为一种快速、使用简便，低成本消耗的检测技术，有望取代传统血培养检测技术，为血培养中病原菌的快速诊断提供有力支持。此外，临床的尿液和脑脊液标本也可以经一定处理后，用质谱技术进行蛋白谱的分析用于疾病的辅助诊断。

3. 真菌鉴定：有学者应用MALDI-TOF MS对327株菌（其中19株为酵母菌）在种的水平上鉴定正确率为61株为酵母菌）的鉴定正确率为92%。

4. 非结核分枝杆菌鉴定：国外学者对107株分枝杆菌临床分离株（包括结核分枝杆菌复合体），利用声波降解的热失活方法和利用玻璃珠进行细胞裂解的方法进行失活和提取，再利用MALDI-TOF MS方法进行鉴定，发现两种方法在种/属水平上成功鉴定率分别为82.2%和88.8%。周昭彦等采用MALDI-TOF MS对83株非结核分枝杆菌（临床分离非结核分枝杆菌15株和医院供水系统环境分离非结核分枝杆菌68株）进行快速鉴定方法及其可行性、准确性和重复性进行研究，并得出结论认为MALDI-TOF MS可快速准确地鉴定临床和环境分离的非结核分枝杆菌，在临床实验室常规鉴定方面有着较好的应用前景。

5. 质谱技术检测病原菌耐药性：除快速鉴定外，质谱技术也被尝试用于检测一些临床常见的耐药基因，例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、万古霉素耐药的肠球菌等的识别，鲍曼不动杆菌相关的耐药机制与产生条件等，为控制耐药菌株播散流行及治疗提供新的策略。

质谱技术为临床微生物实验室提供了快速而准确鉴定细菌、分枝杆菌、真菌等的方法，其中临床标本的直接鉴定成为未来研究的方向。将MALDI-TOF MS与全自动药敏检测仪相连，整合到实验室自动化流水线后，可以提高检测速度，缩短患者住院时间，提高疗效，降低医院和患者的经济负担。另外MALDI-TOF MS与其他分子生物学检测技术联合，可以对临床产酶菌株的检测方法、基因分型及测序、蛋白质组学方面开展更加深入的研究。MALDI-TOF MS有望成为临床实验室微生物鉴定分型等领域发展的重要方向。