质谱研究蛋白质相互作用（一）

　　质谱技术已经成为了蛋白质组学研究的主力。这种技术方法能精确的检测多肽，从而帮助研究人员识别并测序多肽分子，分析它们的特征，了解它们如何进行化学修饰的。

　　但大多数蛋白质并不是单独行动的，一些关键的生物学过程，如DNA 复制、转录、翻译、细胞分裂和能量生成都依赖于大型蛋白复合物的行为，这些蛋白复合物常常涉及几十个亚基，十分复杂，传统的质谱方法难以进行研究。

　　来自西北大学蛋白质组研究中心的设备主任Philip Compton表示，确实，蛋白复合物难以进行研究，许多类型的分析都用不上。大多数复合物都由非共价作用连接在一起，瞬间组合，或者定位在细胞膜上，因此为样品准备增加了难度。而且虽然一些复合物相对来说富集，但是还是有一些数量很少，这也进一步阻碍了检测和分析。

　　从质谱技术的角度来说，分析质量大约为500kDa的蛋白复合物，问题在于大小，“对于质谱技术，这么大的尺寸传统技术很难分析，”Compton说。即使你能将它们弄进质谱仪中，也需要一种计算方法来分析存在的蛋白，此外正常的样品准备过程也会令蛋白变性，破坏蛋白复合物。

　　为此研究人员不断改进质谱技术，希望能通过技术改进来解决这个问题：

　　确定亚基组成

　　研究员：西北大学蛋白质组研究中心的设备主任Philip Compton

　　项目：高通量top-down 蛋白质组学

　　解决方案: 如果说蛋白复合物是洋葱的话，那么Compton就采用了一种逐层剥离的进行研究。他与Thermo Fisher公司的研究人员合作，研发出了一种基于 Orbitrap 的质谱仪，完成后被称之为MS3的系统。

　　Orbitrap 脱胎于由通用电气公司的K. Kingdon于1923年发明的一个称为Kingdon trap的离子捕集装置。经过多年的发展，成为了一种全新的质量分析器。Thermo Fisher也基于此发展出了多种质谱仪，在各个领域发挥着重要的作用。

　　Compton进行的这种基于Orbitrap 的MS3研究主要就是分析样品中所有复合物，每次大约分析10-15种——通过捕获，放进一个惰性其它分子装置中碾碎，弹碰一个亚基，然后进行称重，测序，再然后就是复核。

　　由于这一设备还未完全构建成，因此Compton将这些称为“伪-MS3”实验。从本质上来说，这一设备就是分离了蛋白复合物，对碎片进行分析，并重复这一过程（Anal Chem, 85:11163-73, 2013），“我们将这个技术实验拆分成两步，但实际上都是做的同样的事情，”Compton说。

　　Compton和他的团队已经开始将这用于参与代谢的蛋白复合物研究中。比如乳酸脱氢酶 (LDH) ，一种由两个M (muscle) 和 H (heart) 亚基组成的145 kDa蛋白复合物，它可以有五种构成：MMMM，MMMH，MMHH，MHHH和HHHH。

　　利用MS3系统，Compton说他可以分辨出不同的蛋白组成，以及亚基可能出现的翻译后修饰，并确定每种修饰的丰度。目前他希望可以利用这种方法定量分析不同细胞和组织类型中LDH的差异。

　　设备装置：Compton研究组采用的是Thermo Fisher的 Orbitrap-based Q Exactive HF mass spectrometer，这是一种组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪，威力巨大。你也可以选择其它相似的系统，如 Exactive Plus EMR Orbitrap system，不过由于EMR缺少Compton定制硬件的“高质分离能力”，因此应用范围可能会受限。他表示，“如果你的复合物相对来说比较纯，那么可以进行这样类似的实验。”