超净工作台人胎盘间充质干细胞的分离与鉴定实验流程

 实验材料

1. 1. 1 主要仪器及试剂倒置显微镜( Olympus，日本) ，二氧化碳培养箱( Thermo，美国) ，超净工作台( 博科生物) ，移液器( Eppendorf，德国) ，染色体核型分系统( Cytovision，AI，UK) ，流式细胞仪( BD，美国) ，胎牛血清( FBS，Gibco) ，L － DMEM( Invitrogen) ，青/链霉素，Antibiotic( Invitrogen) ， IV型胶原酶( Collagenase IV，Gibco ) ，Dispase Ⅱ( Roche) ，L － 谷氨酰胺( Invitrogen) ，鼠抗人单克隆抗体IgG2a － FITC， IgG1 － PE，CD29 － PE，CD34 －PE，CD44 － FITC，CD105 － FITC( 均为BD 公司生产) ，植物细胞凝集素( Phaseolus vulgaris agglutinin

1. 2 实验方法

1. 2. 1 胎盘间充质干细胞的分离剪取胎盘绒毛膜面1 ～ 2cm 厚的组织，剪成1mm × 1mm × 1mm 的碎块，用PBS 漂洗至无色，用240U·mL － 1 DispaseⅡ和270U·mL － 1 Collagenase IV 37℃ 水浴消化1h，振荡后静置1min，使液体自然分为三层，吸取中间层悬液于离心管中，加入PBS，摇匀后700r·min － 1离心5min，弃上清，加入3mL 间充质干细胞培养液重悬沉淀，700r·min － 1 离心5min，弃上清。加入适量培养液混匀，转入细胞培养瓶中，37℃，5%CO2培养箱中培养。

1. 2. 2 胎盘间充质细胞的继代培养细胞生长至80%时，进行胰酶消化传代。传代时，以0. 25% 胰蛋白酶消化3 ～ 4min，加细胞培养液终止消化，700r·min － 1离心10min，弃消化液，加入细胞培养液吹打混匀，收集细胞悬液，接种于细胞培养瓶，置于37℃，5%CO2培养箱中培养。

1. 2. 3 胎盘间充质细胞干细胞特异性抗原的鉴定选取处于指数生长期的第三代及冻存复苏后正常生长中的胎盘间充质细胞，用0. 25% 胰蛋白酶消化后，收集细胞悬液于离心管中，调整细胞浓度为1 × 105·μL － 1 ; 取6 只试管，每管分别加15μL鼠抗人单克隆抗体CD29 － PE、CD34 － PE、CD44 －FITC、CD105 － FITC，以鼠抗人IgG2a － FITC、IgG1 － PE 作为阴性对照，再分别加入150μL 细胞悬液混匀，室温避光放置10min，之后再用PBS 洗2次，流式细胞仪检测，Cellquest 软件获取与分析。

1. 2. 4 胎盘间充质细胞染色体核型分析用秋水仙素( 终浓度为0. 05μg·mL － 1 ) 分别处理第二代和第十四代的胎盘间充质细胞2h 后收集细胞，用0. 075mol·L － 1 的KCl 溶液5mL 低渗处理细胞30min，固定、制片。将制片标本置65℃烘烤3h，室温存放3 ～ 7d。37℃ 0. 25% 胰蛋白酶溶液中预处理10 ～ 20s，然后用GKN 液和自来水依次漂洗数秒，立即用Giemsa 染液染色10 ～ 15min，封片，显微镜下观察并作染色体核型分析。