超灵敏纳米流式分析仪在巧选细胞囊泡最佳参考材料中...

超灵敏纳米流式分析仪在巧选细胞囊泡最佳参考材料中的应用

胞外囊泡做为细胞间通讯的重要媒介，在细胞生理稳态的维持方面和病理发生发展的过程中发挥着重要的作用，正渐渐成为基础科学和临床研究的一个主要研究对象。然而针对胞外囊泡的研究，在世界范围内一直缺乏相对统一的研究标准或大小评估参考材料。在以往的研究报道中，曾有文献提出使用自然存在的，具有生物特性的参考材材料（如病毒颗粒和脂质体）作为胞外囊泡研究的参考材料。然而，这些材料的各种理化特性与胞外囊泡的生物特性还相距甚远。
 
近日，芬兰科学家Valkonen S和其合作者的研究工作，为胞外囊泡参考材料的发掘工作提供了新的思路。研究人员，通过查取文献和调查问卷（图1），以及实验测试，成功找到一种名为Nanoerythrosomes (Nano E)的胞外囊泡参考材料。其中，Nano E是研究人员利用特殊方法破裂红细胞过程中产生的囊泡。这种Nano E拥有更加接近细胞源性胞外囊泡（如红细胞自然产生的胞外囊泡eryEVs）的折射率（RI=1.37），更加适合做囊泡大小评估的尺寸(Nano E的大小尺寸绝大多数分布在200nm左右)（图2），更加适合做荧光标记的特性等特点（图3）。这项创新性的研究工作，为加快胞外囊泡研究领域建立统一研究体系，促进该领域研究成果的可借鉴性以及临床应用转化的进程，奠定了坚实的基础。

在该项研究成果中，其中一项引人注目的工作是：研究人员利用胞外囊泡分析最常用的流式分析法，借助英国Apogee超灵敏纳米流式分析仪A50 Micro，成功完成对Nano E各参数的分析（如在分析荧光标记的过程中，同时监测各Nano E的大小）。这些工作的顺利完成，主要归功于A50-Micro超高的散射光灵敏度（最小检测80nm的材料）和精细的分辨率（10nm）-克服了传统流式散射光检测的限制（检测下限为500nm，在分析占有绝大部分比例500nm以下囊泡时会面临极大挑战）。这种技术优势，使Apogee A50 Micro不仅是只借助散射光就可精确分析胞外囊泡（100-1000nm）以及相应的参考材料，同时还可为荧光标记检测提供必不可少的参考信息。因此，Apogee A50 Micro 已被欧洲国家计量研究协会评定为检测胞外囊泡的最灵敏分析系统。由于传统流式检测法，通常借助荧光标记来对进行信息表征属，同时所分析样品中难免会有对荧光标记产生非特异干扰的细胞碎片或膜脂类物质，因此，利用荧光标记技术检测囊泡，如果想获得精确的实验数据，借助散射光信息来排除非特异性干扰物质，将变得格外重要。此外，囊泡表面抗原表达丰度和抗原抗体结合效率也会限制胞外囊泡的荧光标记检测，这也将在很大程度上限制传统流式的囊泡检测应用。由此可见，在分析胞外囊泡及相应参考材料的研究体系中，Apogee超灵敏纳米流式A50-Micro显然已经成为最理想的流式分析系统。

图1，A:研究人员针对各参考微球所做的权重分析统计，其中参考材料的生化组成成分为最受关注 因素。B:最理想的生物参考材料物理生化特性。

图 2，参考Apogee标准混合微球，用Apogee A50 Micro分析无荧光标记的eryEVs和Nano E。其中纵坐标代表绿色荧光标记强度，横坐标代表 A50 Micro大角度散射光强度（用于评估样本的大小）。

图 3，与eryEVs相比，Nano E更适合做CD235a抗体标记。其中纵坐标代表绿色荧光标记强度，横坐标代表 A50 Micro收集的大角度散射光强度。

更多详情请参考：
Valkonen S, Van d P E, B?ing A, et al. Biological reference materials for extracellular vesicle studies. [J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 2016.