超高效液相色谱提高色谱分离能力

　　通过超高效液相色谱(ACQUITY UPLC)提高色谱分离能力并减少溶剂用量

　　在当今的经济形势下，需要以较少的资源实现更多成果，而“快速”是分析化学领域内经常听到的一个主题。液相色谱法已成为药物分析、环境监测、食品检验和水质监测等领域内众多定量及定性分析的主要工具。通过ACQUITY UPLC^®系统取得的生产能力、选择性及特异性除了比传统的HPLC消耗更少的溶剂外，还可以改善色谱分析结果，使实验工作更加高效。

　　分析型HPLC经常采用4.6毫米 x 150毫米或250毫米的色谱柱，填充物质的粒度为3.0~5.0微米，工作流速为1.0~1.4毫升/分钟。这样，每个样品的HPLC分析时间便是15~60分钟。典型的批量需要10~20小时完成，分析结果在第二天之前无法用于批签发、下一个临床剂量、工厂的清洁等方面的决策。流速为1.4毫升/分钟时，这些HPLC系统每20小时日消耗约1.5升溶剂，其中通常包括50%的有机溶剂。这些溶剂必须外购并弃置，这一切都会增加总体分析的成本。在平均250日的工作年中，最多会增加近200升的有机溶剂;购买每升乙腈的约需100美元，相当于20,000美元的可消耗成本。鉴于近期乙腈成本的增加以及全球某些地区的缺货现状，非常需要更加高效地利用该有毒溶剂。图1所示为HPLC在制药工业的一个应用实例 – 奎硫平杂质分析的代表性样品图谱;从图中可见，梯度分析时间为51分钟，色谱柱重新平衡需要16分钟。

　　亚2微米多孔柱颗粒的出现以及设计用于利用这些颗粒的优势的仪器均提高了色谱分析的能力。亚2微米颗粒色谱效能的增加可显著减少分析时间。因为色谱柱的色谱分辨能力与色谱柱长度成正比而与色谱柱粒径成反比，亚2微米材料效能的增加，可减少色谱柱长度而达到相同的效能。可以通过比较l/dp比(色谱柱长/粒度)来评价;对于一个粒度为5.0微米的150毫米长的色谱柱，其l/dp比为150/5，比值为30。由一个5.0微米粒子移动至一个1.7微米的色谱粒子时，可以取色谱柱长度为50毫米而不会改变试验的分辨率。由于色谱柱长度随试验的三个因素之一而减小，时间也应该随三个因素之一而减少，从而提高流量。减小粒度时，最佳流动相线性速度与粒度成反比增加。因此，由一个5.0微米粒子移动至一个1.7微米的色谱粒子时，流动相速度增加3倍;与色谱柱长度减少3倍相结合，最多可减少9倍的分析时间。

　　图1 硅硫平的反相HPLC分离

　　图2A和图2B所示的数据说明由一个5.0微米粒子移动至一个1.7微米的色谱粒子时用于诊断分析和杂质分析分析时间减少了。我们从该例中发现，1.7微米粒子的试验效能及分辨率与5.0微米粒子的不相上下，且分离度十分相似。

　　图2 地达诺新及其杂质的HPLC与UPLC分离(标为A-F)。2A. 5.0微米粒度的HPLC分离。2B. 1.7微米粒度的UPLC分离。

　　实际上，科学家们在使用UPLC^®时都会因为增加了分离度和较高的色谱波峰间隔而折衷选择流量，因此方法的稳健性更强。由亚2微米颗粒物质获得的色谱效能增加与UPLC要求的较短的色谱柱长度相结合，会产生较尖锐、同时更加集中的波峰，从而简化了试验过程，例如在生物分析法中。质谱学会已经利用增加的灵敏度和更短的分析时间来提高UV和LC/MS试验的灵敏度。

　　为了实现这些亚2微米颗粒的色谱效能，必须仔细控制柱前和柱后的谱带增宽，这对于恒溶剂模式(isocratic mode)下的运行尤为重要。ACQUITY超效能LC^®系统专门设计用于开发可由亚2微米颗粒LC获得的色谱效能，柱前容量约为80微升，且色散性极低。没有这种严格的控制，波峰形状就会受到破坏，从而导致较宽的拖尾峰。

　　图3A所示为由硅硫平杂质法向亚2-微米颗粒(2.1毫米 x 100毫米，1.7微米)C18 UPLC法的过渡。其中，我们发现分析时间已经减少至仅20分钟，而峰分辨率也已经降低。主峰周围的小杂质显示清晰，且主API峰的分辨率与HPLC分离法的不分上下。由HPLC移向2.1毫米UPLC色谱柱时，由于2.1毫米色谱柱的分析时间更快且体积流速更低，节省溶剂的量确定为82%。假设HPLC系统在一年52个工作周内每周工作5天、每天工作20小时，仪器将在这段时间内进样4477次，消耗掉419升溶剂。

　　与UPLC系统相比，后者进样相同的次数会消耗71升流动相。当流动相为50%左右的乙腈时，在整个分析过程中就可以节省174升乙腈，成本按100美元/升计算，每年节约财务支出17,000美元。

　　图 3. 奎硫平及其杂技的UPLC逆相分离。3A. 2.1毫米色谱柱 I.D. 3B. 1.0毫米色谱柱 I.D.

　　ACQUITY UPLC系统的独特设计最大限度地减小了系统的延迟体积和系统的分散度，支持使用填充有亚2微米物质的1.0毫米色谱柱。图3B中所示的数据表明在ACQUITY UPLC BEH C18 1.0毫米 x 100毫米，1.7微米色谱柱上进行的相同的奎硫平杂质分析。样品是在相同的梯度条件下洗提的，其流速大小为0.181毫升/分钟;这表示溶剂用量比2.1毫米HPLC分离法减少77%。因此，若每年同样要进行4477次进样，1.0毫米分离只会消耗16.30升溶剂，因此仅消耗8.15升乙腈，溶剂用量减少97%。与HPLC分析法相比，1.0毫米UPLC分析只需800美元购买乙腈的成本，相当于进行相同次数的分析比HPLC法节省20,000美元。图4所示的数据说明与辅助显像法(aid visualization)相比UPLC在1.0毫米和2.1毫米规模下溶剂和成本的节省情况。通过该数据得知，UPLC不仅更加高产，而且更加经济，因为该方法每年可以少消耗数百升溶剂。

　　图 4. UPLC在1.0毫米和2.1毫米色谱柱下相对HPLC的溶剂和成本节约情况。

　　结论

　　可商购的亚2微米颗粒LC色谱柱的出现及可利用这些色谱柱的色谱潜力的仪器使色谱工作人员和LC/MS科学工作者能够提高其分析工作的灵敏度、质量和速度。ACQUITY UPLC系统的独特设计使科学工作者能够以一种比以往更高效的方式取得这些成果。系统不仅更加高效，还比HPLC或“快速LC”(采用4.6毫米色谱柱，流速更高)或单片固相显著减少溶液用量。本白皮书所示的实例说明，通过迁移至2.1毫米规模的UPLC法，可节省溶剂82%;通过迁移至1.0毫米规模的UPLC法，可节省溶剂97%，累计每年可节省数万美元。

　　这样的成本节约具有重要的商业意义，使用更少的溶剂和产生更少的废物有益于环境保护。

　　相关厂商：Waters公司