转化细胞大规模培养技术的操作方式

转化细胞深层培养可分为：分批式、流加式、半连续式、连续式、连续式和灌注式五种。

一、分批式培养（batch culture）  是细胞规模培养发展进程中较早期采用的方式，也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器，将细胞扩大培养后，一次性转入生物反应器内进行培 养，在培养过程中其体积不变，不添加其它成分，待细胞增长和产物形成积累到适当的时间，一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。

该方式的特点:

操作简单。培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。反应器系统属于封闭式，培养过程中与外部环境没有物料交换，除了控制温度、pH值和通气外，不进行其他任何控制，因此操作简单，容易掌握；

直观反映细胞生长代谢的过程。因培养期间细胞生长代谢是在一个相对固定的营养环境，不添加任何营养成分,因此可直观的反映细胞生长代谢的过程,是动物细胞工艺基础条件或"小试"研究常用的手段；

可直接放大。由于培养过程工艺简单，对设备和控制的要求较低，设备的通用性强，反应器参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，在工业化生产中分批式培养操作是传统的、常用的方法，其工业反应器(Genetech)规模可达12000L。

分批培养过程中，细胞的生长分为五个阶段：延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期，见图1。分批培养的周期时间多在3-5天，细胞生长动力学 表现为细胞先经历对数生长期（48-72h）细胞密度达到zui高值后，由于营养物质耗劫或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡，表现出典型的生长 周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。

二、流加式培养（feeding culture）

1、流加式培养是在批式培养的基础上，采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞，细胞初始接种的培养基体积一般为终 体积的1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的营养物或培养基，从而使细胞持续生长至较高的密度，目标产品达到较高 的水平，整个培养过程没有流出或回收，通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，浓缩、纯化目标蛋白。

2、流加培养特点：

流加培养细胞生长速率、营养物消耗和代谢产物抑制情况，流加浓缩的营养培养基。流加的速率与消耗的速率相同，按底物浓度控制相应的流加过程，保证合理的培养环境与较低的代谢产物抑制水平。

培养过程以低稀释率流加，细胞在培养系统中停留时间较长，总细胞密度较高，产物浓度较高。

流加培养过程须掌握细胞生长动力学，能量代谢动力学，研究细胞环境变化时的瞬间行为。流加培养细胞培养基的设计和培养条件与环境优化，是整个培养工艺中的主要内容。

在工业化生产，悬浮流加培养工艺参数的放大原理和过程控制，比较其它培养系统较易理解和掌握，可采用工艺参数的直接放大。

流加培养是当前动物细胞培养中占有主流优势的培养工艺，也是近年来动物细胞大规模培养研究的热点。流加培养中的关键技术是基础培养基和流加浓缩的营 养培养基。通常进行流加的时间多在指数生长后期，细胞在进入衰退期之前，添加高浓度的营养物质。可以添加一次，也可添加多次，为了追求更高的细胞密度往往 需要添加一次以上，直至转化细胞密度不再提高；可进行脉冲式添加，也可以降低的速率缓慢进行添加，但为了尽可能的维持相对稳定的营养物质环境，后者采用较多； 添加的成分比较多，凡是促细胞生长的物质均可以进行添加。流加的总体原则是维持细胞生长相对稳定的培养环境，营养成分即不过剩而产生大量的代谢副产物造成 营养利用效率下降而成为无效的利用；也不缺乏导致细胞生长抑制或死亡。

3、流加工艺中的营养成分主要分为三大类：

葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和主要的碳源物质，然而当其浓度较高是会产生大量的代谢产物乳酸，因而需要进行其浓度控制，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳。

谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物质和主要的氮源物质，然而当其浓度较高是会产生大量的代谢产物氨，因而也需要进行其浓度控制，以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳；

大规模培养中细胞凋亡主要由于营养物质的耗竭或代谢产物的堆积引起，如谷氨酰胺的耗竭是zui常见的凋亡原因，而且凋亡一旦发生，补加谷氨酰胺已不能逆转凋亡。另外，动物细胞在无血清、无蛋白培养基中进行培养时，细胞变得更为脆弱，更容易发生凋亡。

氨基酸、维生素及其他：主要包括营养必需氨基酸、营养非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养成分 如胆碱。添加的氨基酸形式多为左旋氨基酸，因而多以盐或前体的形式替代单分子氨基酸，或者添加四肽或短肽的形式。在进行添加时，不溶性氨基 酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性pH值部分溶解，可采用泥浆的形式进行脉冲式添加；其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕动泵进行缓慢连续流加。

4、流加式培养分为两种类型：单一补料分批式培养和反复补料分批式培养。

单一补料分批式培养是在培养开始时投入一定量的基础培养液，培养到一定时期，开始连续补加浓缩营养物质，直到培养液体积达到生物反应器的zui大操作容积，停止补加，zui后将细胞培养液一次全部放出。该操作方式受到反应器操作容积的限制，培养周期只能控制在较短的时间内。

反复补料分批式培养是在单一补料分批式操作的基础上，每个一定时间按一定比例放出一部分培养液，是培养液体积始终不超过反应器的zui大操作容积，从而在理论上可以延长培养周期，直至培养效率下降，才将培养液全部放出。

三、半连续式培养（semi-continuous culture）

1、半连续式培养又称为重复分批式培养或换液培养。采用机械搅拌式生物反应器系统，悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新的培养液补足到原有体积，使反应器内的总体积不变。

这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基，让其生长至一定的密度，在细胞生长至zui大密度之前，用新鲜的培养基稀释培养物，每次稀释反应器培养体 积的1/2~3/4，以维持细胞的指数生长状态，随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中，每隔一定时间，定期取出部分培养 物，或是条件培养基，或是连同细胞、载体一起取出，然后补加细胞或载体，或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子，继续培 养，从而可维持反复培养，而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量，经过几次 的稀释、换液培养过程，转化细胞密度常常会提高。

2、半连续式特点：

培养物的体积逐步增加；

可进行多次收获；

细胞可持续指数生长，并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平，培养过程可延续到很长时间。

该操作方式的优点是操作简便，生产效率高，可长时期进行生产，反复收获产品，可使细胞密度和产品产量一直保持在较高的水平。在动物细胞培养和药品生产中被广泛应用。