转基因斑马鱼的构建

实验概要

本实验对斑马鱼导入含 EGFP的质粒，观察其在动物体内的表达情况，在斑马鱼体内，绿色荧光蛋白从原肠胚到出苗期均能在荧光显微镜下观察到绿色荧光。

主要试剂

EGFP、绿色荧光蛋白基因、pEGFP-N2载体、E.coli

主要设备

试管、试管架、可调式微量加样器、电泳仪、电泳槽、染色缸、42℃恒温水浴箱、冰浴、恒温振荡箱、超净工作台、手动显微注射器、体式显微镜、硼硅酸玻璃毛细管、倒置显微镜、摄像系统(CCD)、自动水循环系统一套，孵化水槽、培养皿、解剖镜、小规模质粒提取试剂盒

实验步骤

1. 转染细菌的培养

   1) 培养基的制备：称取胰蛋白胨 3g，酵母提取物 1.5g，NaCl 3g，于一500 mL 的三角瓶中，加入蒸馏水至 300 mL 溶解。若配制固体培养基，则需加入 4.5 g 琼脂(1.5%)，然后用 NaOH 调 pH 至 7.5。分装于 3 个 250 mL 的三角瓶中，加塞，包扎。

   2) 培养基的灭菌与消毒：在灭菌锅中，加入适当的水，放入已包扎好的培养基，盖好盖子，加热。当压力升至 0.05 MPa 时，打开放汽阀，排除冷空气，当压力回到 0 时，关闭放汽阀，当压力升至 1.034 MPa 时保持 15-30 分钟后，停止加热，压力降为 0 时，打开放汽阀排汽取物。

   3) 含 Amp 的 LB 固体培养基：将配好的 LB 固体培养基高压灭菌后冷却至 60℃左右，加入 Amp(氨苄青霉素)储存液，使终浓度为 50 μg/mL，摇匀后铺板。

   4) 接种加甘油保存的分别含质粒的 Ecoli.，每管接种体积为 10 微升。

   5) 37℃摇床过夜培养 24h.

2. 质粒的小量提取

   1) 样本处理：收集已培养12～16 小时的菌液13ml，12000rpm 离心1 分钟，尽量吸除上清。

注：菌液较多时可以通过多次重复离心将菌体收集到1 个离心管中。菌液收集量由菌浓而定，收集菌体过多会反而降低裂解效果。

   2) 悬浮：向菌体沉淀的离心管中加入250ul 溶液Ⅰ，用移液器反复吹打或涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀。

   3) 裂解：加入250ul 溶液Ⅱ于细菌悬液中，温和地上下颠倒6～8 次，使菌体充分裂解，加1 管混合1 管，确保溶液充分、及时的混匀。充分裂解后的菌液会变得相对粘稠；为防止DNA 断裂，避免剧烈混匀操作及裂解时间过长。

   4) 中和：加入350ul 溶液Ⅲ，立即温和上下颠倒6～8 次，充分混匀，加1 管混合1 管。此时会出现白色絮状沉淀，静置2 分钟，12000rpm 离心5分钟(可适当延长至10min)。

注：溶液Ⅲ加入后应立即混匀，避免产生局部沉淀。若上清液中仍存在微小白色沉淀，可重复离心后取上清。

   5) 吸附：小心地将上清液转移至吸附柱中，12000rpm 离心 30～60 秒，弃收集管中废液，然后将吸附柱重新套入废液收集管中。若上清一次加不完，可重复操作(转移时不可吸入沉淀，此步很重要)。

   6) 漂洗：向吸附柱中加入 600ul 漂洗液 PW(使用前请检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm 离心 30～60 秒。

   7) 重复步骤 6，弃收集管中废液。

   8) 将吸附柱套于收集管中，10000rpm 离心 2 分钟。

注：此步骤绝对不可省略，目的是去除吸附柱中残余的漂洗液，因为漂洗液中乙醇的残留会影响后续实验(酶切，PCR 等)。

   9) 洗脱：将吸附柱置于一干净的 1.5ml 离心管中，向吸附柱膜中央部位悬空滴加 50～100ul 溶解液 TE 或灭菌双蒸水(pH值在7.0-8.5)，室温静置 2～10 分钟，12000rpm 离心 2 分钟，即得提取质粒 DNA，-20℃保存。

3. 将提取出的质粒双酶切，将其线性化并导入荧光蛋白基因，经 1.0%琼脂糖凝胶电泳，得到一大小为 6.0 kb 的带，将起切下纯化并回收。

4. 采用光周期诱导方法得到斑马鱼受精卵。

5. 受精后第一次卵裂前进行基因注射，每次注射的 DNA 溶液约 1-2 nL。转基因受精卵置于 Holtfreter’s 于室温培养，适时更换培养液，待胚胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀释，发育至心跳期以后，将胚胎转移到暴气的冷开水中培育。

6. 在 480nm 激发光照射的荧光倒置显微镜下观察 EGFP 在转基因斑马鱼胚胎中的表达。