转基因植物的GUS表达分析

实验概要

本实验对转基因拟南芥进行了GUS组织化学染色分析及GUS活性测定。

主要试剂

X-Gluc，丙酮，乙醇，BSA，考马斯亮蓝溶液

主要设备

显微镜(BX50 OLYPUS)，研钵，高速离心机，Nano drop核酸蛋白测定仪

实验材料

转基因拟南芥

实验步骤

1. 转基因植物的GUS组织化学染色分析

   1) 配置染色液：

取9.7mL上述缓冲液(除X-Gluc外)，加0.3mL X-Gluc母液即可；

   2) 将材料在90%丙酮中(冰浴)轻微固定15-20min；

   3) 在缓冲液中(染色液去掉X-Gluc)漂洗3次，共计l0min；

   4) 将需要染色的拟南芥植株或组织放在1.5 mL离心管中，加入染色液浸过材料抽气5-l0min， 37℃过夜，染色12-16h；

   5) 用50%，60%，70%，80%，90%乙醇依次脱水30min后，在100%乙醇中放置1h；观察、照相(BX50 OLYPUS，显微镜)。

2. 转基因植物的GUS活性测定

   1) 新鲜植物组织GUS蛋白的提取

取不同株系转基因拟南芥组织约0.lg，用石英砂研磨；加入1mL提取缓冲液，研成匀浆；5000 rpm/min离心l0min，收集上清液，于-20℃冰箱中保存备用。

   2) GUS蛋白提取液的蛋白含量测定

取1ul GUS蛋白提取液点到Nano drop核酸蛋白测定仪上，测出蛋白浓度；

或者用Bradford法测定，方法如下：

      a. 制作标准曲线：配制25ug/mL BSA母液：称取2.5mg BSA，加入0.5 mL提取缓冲液，用H₂O定容100mL，按下表制作BSA梯度液。从中取4mL加入1mL考马斯亮蓝溶液，混匀，室温放置2min，测定595nm的吸收值。吸收值对蛋白浓度作图绘制标准曲线。

      b. 取植物材料GUS提取液20uL，加H₂O至4mL，加入1mL考马斯亮蓝溶液，混匀，室温下放置2min。测定595nm光吸收值，根据标准曲线计算样品蛋白质含量。

   3) CUS酶活反应

      a. 将反应缓冲液于37℃预热；

      b. 取数只1.5 mL离心管，分别加入900uL反应终止液，编号；

      c. 取1支离心管并加入900uL预热的反应缓冲液，再加入100uL提取缓冲液，混匀，立即取出100uL加入到终止液中，此为反应。时的样品，并开始严格记时；

      d. 终止液中将反应管放入37℃水浴中进行酶反应15min，之后取100uL反应液，加入到混匀，作为酶反应20min时的样品，供荧光测定用；

      e. 在激发光365nm，发射光455nm，狭缝10nm条件下测各样品的荧光，以反应0时样品为空白溶液，测样品荧光量。

   4) 酶活力计算：以酶反应时间对4-MU含量作图，直线部分的斜率即为酶反应初始阶段的速度。

酶活力单位定义为：每min水解4-MUG生成1mmol或1mg、1ug、1ng 4-MU的酶量为一个活力单位，根据定义求出各样品的酶活力。