转基因植物Gus报告基因的检测

一、原理

Gus (b-glucuronidase)基因作为一种报告基因，在植物遗传转化研究中有广泛的用途。Gus基因来自于大肠杆菌，编码b－葡聚糖苷酶（一种水解酶），可催化底物5－溴－4－氯－3－吲哚葡聚糖醛酸苷（5－bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide，缩写为X－Gluc）分解，产生肉眼可见的深兰色化合物，借此用来观察转基因植物中外源基因的表达情况，鉴定转基因植株。

二、目的

了解转基因植物中基因表达的器官、组织和细胞的特异性，掌握Gus报告基因表达的组织化学定位的方法。

三、材料与试剂

1、转基因植物的组织、器官、种胚或幼苗。

2、同种非转化植物的组织、器官、种胚或幼苗。

3、50mM磷酸缓冲液(pH 7.0)。

4、染色液：100mM　K3[Fe(CN)6], 100mM K4[Fe(CN)6] 10mM Na2EDTA, 0.001% (v/v) triton X-100, 20%甲醇，0.5mg/ml X-Gluc, 磷酸缓冲液(50mM, pH 7.0)。

5、70％乙醇。

四、操作步骤

1、将准备好的材料冲洗干净，用吸水纸吸干，浸在上述染色液中37℃恒温条件下保温过夜。

2、转入70％乙醇中脱色2－3次，去除叶绿素，至阴性对照材料呈白色时为止。

3、肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为Gus基因表达的位点。

4、83％、95％、100％乙醇中脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

5、常规石蜡切片法切片，番红染色。

6、显微镜下观察、拍照。

五、说明

1、要设立严格的阴性对照，即用同样的未转化的材料按相同的方法同时进行染色。如阴性对照显示兰色，其原因可能是：A）材料和试剂被细菌感染；B）保温时间过长。

2、染色液中的甲醇可抑制细菌生长，长时间染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素，短时间染色也可以不加。

3、叶绿体含量高的材料染色后要进行脱色。