转运反应成分的制备实验

APC 悬浮液 HEPES NaCl SMCC

微量离心管 Sephadex G50 脱盐柱

1. 在一微量离心管中，4℃，10000 g 离心 APC 悬浮液 5~10 分钟，吸走上清。

2. 用 0.1 mol/L HEPES（pH 7.4），0.1 mol/L NaCl 重悬浮沉淀至浓度为 5 mg/ml。用这种缓冲液透析几次去除残留的硫酸铵。

3. 临用前用透析液溶解硫代 SMCC，浓度为 10 mg/ml。

4. 按 0.1 mg 硫代-SMCC/1 mg APC 的比例将硫代-SMCC 加到蛋白质中，冰上孵育 45 分钟。

5. 将修饰后的 APC 过一 5 ml 的 Sephadex G50 脱盐柱，柱子预先用 0.1 mol/L HEPES，(pH 7.4)，0.1 mol/L NaCl 和 1 mmol/L EDTA 平衡。

6. 通过真空透析或用一离心浓缩装置将 APC 浓缩为 5 mg/ml。

7. 用含 0.4 mmol/L 的三（2-羧乙基）盐酸磷的 G50 柱缓冲液溶解要偶联的肽。

8. 按 1~5 倍的摩尔比例将肽加到含有被修饰的 APC 的试管中，TCEP 的终浓度应为 0.1 mol/L 4℃ 温和搅拌过夜。

9. 加入半胱氨酸至 5 mmol/L 以封闭交联剂中没反应的 APC-马来酰亚胺基团，4℃ 孵育 1 小时。

10. 用 Sephadex G50 脱盐柱或离心浓缩器将 APC-肽聚合物与自由肽分离开来。

11. 将 APC-肽浓缩为 1~2 mg/ml，分成小份在液氮中冷冻，-80℃ 保存。