辛酸／硫酸铵法提纯IgG

实验概要

本实验介绍了辛酸/硫酸铵法提纯IgG的原理和主要步骤。

实验原理

在酸性条件下( pH4.5)，非1gG的蛋白成份(包括白蛋白，部分Ig)，能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。辛酸/硫酸铵法比硫酸铵法能够获得更高纯度的IgG。

主要试剂

1. 辛酸(caprylic acid，CA)，化学纯

2. 硫酸铵，分析纯

3. 60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4.0)

4. NaOH

5. PBS(0.lmol/L，pH7.4)

6. 0.lmol/ L柠檬酸(pH4.0)

主要设备

1. SPA Sepharose 4FF亲合层析柱

2. 紫外分光光度计

3. 高速离心机

4. 透析袋

5. 蛋白电泳装置

6. 酶标板

实验材料

动物腹水

实验步骤

1. 蛋白含量测定

紫外分光光度法测样品在波长260nm，280nm处的I及收光度(A 260，A 280)，蛋白含量按以下公式计算

蛋白量（g/L）=(1.45* A 280- 0.74* A 260)*稀释倍数

2. 主要步骤

   1) 腹水滤纸过滤去沉淀和脂质，滤液用4倍体积60mmo1/ L醋酸缓冲液(pH4.0)稀释后，用NaOH调，PH值至4.5。

   2) 逐滴加入辛酸(终浓度25u1/ml)，室温h搅拌30分钟后，以6000-8000r/min.离心30分钟，收集上清液。

   3) 上清液经滤纸过滤2次，将滤液与10*PBS(0.lmol/L，pH7.4)按10:1比例混合，调pH至7.4，置冰浴冷至40度。

   4) 每毫升上述混合液加0.2778固体硫酸钱，40度搅拌30分钟，以4000-6000r/min离心20分钟，将沉淀溶于少量YBS，透析，测蛋白含量，冻存。

3. 硫酸铵沉淀法

按常规方法将腹水分别经50%，33%饱和度硫酸铵沉淀。

4. 亲合层析

取提取的样品，用0.01lmol/ L Na₂HPO₄ (pH7.4)透析，洗脱使样品中IgG结合于层析柱上，再用0.lmol/ L柠檬酸(pH4.0)洗脱，收集洗脱液即获纯化IgG。

5. SDS—PAGE电泳鉴定抗体纯度

6. 间接ELISA法测定抗体效价

用sIgA包被酶标板，按常规方法测抗体效价。处理细胞，包被酶标板，测定抗体效价。

7. 得率和回收率的计算

每毫升原腹水中提取的抗体量即为得率(Y field，g/ L );提取所得抗体量与原腹水中抗体量之百分比即为回收率(Recovery，%)。