逆转录元件发生反向剪接插入DNA过程的原理与结构基础

　　逆转录元件是一种以RNA为媒介，通过“copyand paste”的方式在基因组中不断扩增的基因元件【1,2】。在哺乳动物基因组中有超过45%的遗传成分都是逆转录元件，因此逆转录转座事件如果在不恰当的地方发生就会导致基因紊乱或者基因疾病等严重后果【3】。

　　II组内含子（Group II introns）作为其中一类逆转录元件，剪接体和长散布核元件（Long interspersednuclear elements, LINE）都曾被认为是起源于它【4】。而II组内含子要发挥它逆转录元件的功能，首先就必须经历正向剪接反应——成熟酶在结合内含子并帮助它从pre-mRNA上切除之余，还通过2’-5’磷酸二酯键将两个外显子连接。与此同时，套索结构的内含子同成熟酶形成了一个逆转录元件复合物参与到逆转录转座事件中。其中，成熟酶是如何在剪接过程中发挥积极作用以及催化活性中心剪接位点是如何发生交换的机制都尚未可知。

图1. 正向剪接与反向剪接原理示意图

　　近日，加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）的Navtej Toor课题组在Cell上在线发表了题为Cryo-EM Structure of a Group II Intron Reverse Splicing into DNA的研究成果。作者通过解析蓝细菌II组内含子反向剪接过程中两种不同阶段的冷冻电镜结构（分辨率均为3.6Å），阐明了II组内含子反向剪接进DNA的结构机理以及剪接过程中位点发生交换的结构基础，同时也揭示了成熟酶在该过程中的功能贡献。

　　基于两种不同反应阶段的电镜结构（图2.A，图2.B），作者详细解释了反向剪接的原理与过程，如图2.C所示。II组内含子与成熟酶形成复合物先和目标DNA结合并形成部分配对的复合体，之后的第一阶段是DVI和DII结构域通过π-π’和η-η’作用相互靠近并将3’端羟基指向活性位点处，有助于酯基交换反应的发生，使得RNA的3’端与DNA的5’端共价连接；反应之后DVI结构域旋转了90度从而与成熟酶thumb-X结构域相互结合，这一构象变化将套索结构的2’-5’磷酸二酯键放置在了催化中心，此时DNA的3’端羟基对其发起第二轮亲核进攻，发生酯基交换反应之后形成共价连接，最终实现了将II组内含子整合进基因组中。

图2. A. II组内含子反向剪接时的Pre-1r阶段电镜结构图； B. II组内含子反向剪接时的Pre-2r阶段电镜结构图； C. DNA整合与活性位点底物交换模型

　　其中，作者发现成熟酶在此过程中发挥了积极促进的作用并将关键位点锁定在thumb-X结构域与DVI结构域的交界面上。因此作者设计了一系列不影响正向剪接反应的成熟酶突变体，结果证明thumb-X结构域与DVI结构域的相互作用不管是对于正向剪接时发生的亲核进攻反应还是对于反向剪接时将套索结构交换至活性位点都十分必要。

图3. thumb-X结构域与DVI结构域的交界面以及关键残基

　　总之，该工作通过对比反向剪接过程中两种不同状态的冷冻电镜结构，细致地解释了逆转录元件发生反向剪接插入DNA过程的原理与结构基础，也首次突出了成熟酶在过程中发挥的重要作用。此外，II组内含子VI结构域的动态变化更是与剪接小体中发生的动态变化相似，为剪接小体的来源奠定了强有力的理论基础。

　　原文链接：

　　https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.06.035

　　参考文献

　　[1] Zimmerly, S., Guo, H., Eskes,R., Yang, J., Perlman, P.S., and Lambowitz, A.M. (1995a). A group II intron RNAis a catalytic component of a DNA endonuclease involved in intron mobility.Cell 83, 529–538.

　　[2] Zimmerly, S., Guo, H., Perlman,P.S., and Lambowitz, A.M. (1995b). Group II intron mobility occurs by targetDNA-primed reverse transcription. Cell 82, 545–554.

　　[3] Deininger, P.L., and Batzer,M.A. (2002). Mammalian retroelements. Genome Res. 12, 1455–1465.

　　[4] Eickbush, T.H. (1999). Mobileintrons: retrohoming by complete reverse splicing. Curr. Biol. 9, R11–R14.