透化细胞和退化细胞器中蛋白质的磷酸化实验

胞外缓冲液 胞内缓冲液 透化缓冲液 标准裂解缓冲液 裂解缓冲液 SDS-PAGE 加样缓冲液 双向-PAGE 裂解緩冲液

这些试剂在后面许多地方要用到，应在进行下述实验前配好。

1. 胞外缓冲液（pH 7.2，37℃）

110 mmol/L NaCl

10 mmol/L KCI

1 mmol/L MgCl₂

1.5 mmol/L CaCl₂

30 mmol/L HEPES

10 mmol/L 葡萄糖

过滤灭菌，4℃ 保存可达 1 个月。

2. 胞内缓冲液（pH7.4，37℃）

25 mmol/L NaHCO₃

120 mmol/L KCl

1 mmol/L KH₂PO₄

10 mmol/L MgCl₂

20 mmol/L HEPES

10 mmol/L 葡萄糖

过滤灭菌，4℃ 保存可达 1 个月。

3. 透化缓冲液（pH7.4，37℃ )

120 mmoI/L KCl

25 mmol/L NaHCO₃

5 mmol/L HEPES

10 mmol/L MgCl₂

1 mmol/L KH₂PO₄

1 mmol/L EDTA

30 μmol/L CaCl₂

该缓冲液含有 100 nmol/L 游离钙离了。过滤灭菌，4℃ 保存几个月。

4. 标准裂解缓冲液（pH 7.4，37℃)

50 mmol/L HEPES

100 mmol/L NaCl

2 mmoI/L EDTA

2 mmol/L EGTA

50 mmol/L NaF

10 mmol/L β-磷酸甘油

1 mmol/L Na₃VO₄

1% NP-40 或 Triton X-100

4℃ 保存可达 6 个月。

5. 2X 裂解缓冲液（pH 7.4，4℃）

100 mmol/L HEPES

200 mmol/L NaCl

40 mmol/L EDTA

4 mmol/L EGTA

100 mmol/L NaF

20 mmol/L β-磷酸甘油

2 mmol/L Na₃VO₄

2% NP-40 或 Triton X-100

为了螯合激酶反应中过剩的镁，该缓冲液含 10X EDTA。4℃ 保存可达 6 个月。

6. 2X SDS-PAGE 加样缓冲液

0.125 mol/L Tris-HCl ( pH 6.8) 室温   4ml

10% SDS (w/v)                                4ml

甘油                                               1ml

β-巯基乙醇                                      0.4ml

水                                                  0.6ml

溴酚蓝                                           20mg

7. 双向-PAGE 裂解緩冲液

20 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0)

0.3% SDS (w/v)

1% β-巯基乙醇（v/v)

8. 双向-PAGE 加样缓冲液

尿素                                                   6g

NP-40                                                4ml

40% 在所需 pH 范围内的两性电解质     0.5ml

DIT                                                     0.154g

水                                                      1.12ml

分成小等份 -70℃ 保存可达 1 个月。