透析得可溶的重折叠σ32单体实验

Tris NaCl

CentriconTM-10 型离心浓缩器 大小排阻髙效液相色谱柱

材料与设备

Centricon^TM-10 型离心浓缩器（Amicon，Inc.)

大小排阻髙效液相色谱柱 TSK-GEL G3000 PWXL(7.8x300 mm)(TosoHaas)

50 mmol/L Tris(pH7.9)+200 mmol/LNaCl

操作程序

用大小排阻 HPLC 色谱检测可溶性单体的形成

1）在拟试的条件下透析样品。

2）从透析袋中取出样品，13000r/min 离心 10 min, 使澄清。保留上清。

3) 若透析时样品的蛋白浓度太低，则可用 Cenricon-10 型离心浓缩器浓缩。于 Centricon-10 管中加 2.0 ml 透析样品，13000r/min 离心 90 min, 或至体积减至原体积的 1/5~1/10。
注：需要选择某一孔径大小的 Centricon 管，以使水和盐能在离心力作用下透过膜而把σ³² 保留下来。Centricon-30 和 Centrioon-100 管的孔径较大，浓缩也较快，但本实验采用 Centricon-10 管，其标称截留分子量为 10000Da, 这是因为σ³² 的分子量是 32000Da 而有些σ³² 会通过较大的孔透出。Centricon 管也可用来改变样品的盐浓度。可简单地将样品浓缩 10 倍，再用另一种缓冲液将其恢复至原体积。能处理更小（0.5 ml;Micrecon 型）和更大（20 ml;Centriprep 型）体积的浓缩器也均可从 Amicon 公司买到。

4) 给大小排阻色谱柱 TSK-GELG3000PWXL(7.8x300 mm) 进样 100~400ul 上清，该柱事先用 50 mmol/L Tris(pH7.9)+200 mmol/LNaCl 在 1 ml/min 流速下平衡，并在相同条件下洗脱，分部收集 0.5-ml 组分，计 30 min。
注：加盐是为了防止蛋白质与聚合物基质的弱离子结合，这种结合作用会使洗脱时间失真，妨碍大小排阻色谱分析正常进行。

5) 用紫外检測器于 280mn 检测柱的流出液，估算作为可溶性单体而流出的物料的比例。
注：应先标定 HPIX 的大小排阻色谱柱，方法是用一组已知分子量的蛋白质在相同洗脱条件下过柱分析。再以分子量标准参照物的出峰时间对其分子量的对数作图，用插入法即可求出分析σ³² 透析样品时所洗联的那种蛋白质的分子量。

6) 如必要，用 SDS-PAGE 电泳分析所选的组分，以证实洗脱峰的一致性。