通过平板裂解和洗脱制备λ噬菌体原种实验

λ 噬菌体原种 大肠杆菌铺平板细菌

氯仿 SM

LB 或 NZCYM 琼脂平板 Sorvall SS-34 或相当型号 水浴 螺口或卡口聚丙稀试管

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿，SM。

2. 培养基

LB 或 NZCYM 琼脂平板



LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖（0.7%)

3. 离心机和转子

Sorvall SS-34 或相当型号

4. 专用设备

加热设备或预置 47℃ 的水浴

螺口或卡口聚丙稀试管（13 mm X 100 mm 或更大)

5. 载体和菌株

λ 噬菌体原种

大肠杆菌铺平板细菌

二、方法

1. 铺平板感染培养物的制备：

对直径为 10 cm 的培养皿，取 10⁵ pfu 的噬菌体（通常约为一个噬菌斑重悬液的 1/10 或一个大噬菌斑重悬液的 1/100）与 0.1 ml 铺平板细菌混匀。

对直径为 15 cm 的培养皿，取 2X10⁵ pfu 的噬菌体与 0.2 ml 铺平板细菌混匀。

至少要设置一个含未感染细胞的对照管，将感染培养物和对照均置 37℃ 培养 20 min，使病毒吸附到细胞上。

如果制备不易生长的 λ 噬菌体原种，则每 0.1 ml 的铺平板细菌就要接种 10⁶ pfu 的噬菌体。

2. 加 3 ml 已熔化的 47℃ 的琼脂糖（10 cm 平板）或 7 ml ( 15 cm 平板）至感染细胞的第一个试管中，通过轻拍或涡旋振荡数秒混匀，立即倒入已标明的琼脂平板中央。尽量避免气泡的产生。旋转平板确保细菌和顶层琼脂糖分布均匀。重复这一步，直到每管中的东西均转移至各个平板中。

3. 将平板于 37℃ 正置约 12~16 h。

在培养过程平板没有倒置，是为了鼓励在平皿表面形成水珠，这使得噬菌体更容易扩散。

在收集时，噬菌斑应相互接触，细菌生长的惟一可见迹象是标志着相邻噬菌斑结合部位的轻薄透明的边缘带。含未感染细胞的平板应形成一片光滑的菌苔。

4. 从培养箱中取出平板，加入 SM ( 10 ml 平板加 5 ml，15 ml 平板加 10 ml )，在 4℃ 摇床上晃动数小时。

5. 用不同的巴斯德吸管分别将各个平板中的 SM 尽可能地转移至螺口或卡口的无菌聚丙烯试管中。

6. 在每个平板中再加 1 ml 新鲜的 SM，轻轻晃动液体，随后将平板倾斜放置 15 min，使所有的液体集中于一个地方，再吸取 SM 并与第一次收集的混合，舍弃平板。

7. 加 0.1 ml 氯仿至含 SM 的各试管中，轻轻地涡旋振荡，然后通过于 4℃ 4000 g ( Sorvall SS-34 为 5800 r/min ) 离心 10 min 去掉细胞碎片。

8. 将上清转移至新的聚丙烯试管中，在每管中加一滴氯仿。将获得的噬菌体平板培养原种于 4℃ 保存。

9. 如 “λ 噬菌体的铺平板培养” 所述，用噬菌斑分析的方法测定每个原种中感染性病毒颗粒的浓度。