酪氨酸激酶分析实验

兔肌肉烯醇化酶

1 mmol L DTT 50 mmol L HEPES（pH 7.0 ）甘油100 mmol L 乙酸5 × 酪氨酸激酶反应缓冲液[γ-32P] ATP 溶液冰 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液

30℃ 水浴和沸水浴

1. 4℃ 最大速度离心 5 min 相当于 100 μg 兔肌肉烯醇化酶的样品，弃上清。

2. 加 10 μl 1 mmol/L DTT/50 mmol/L HEPES， pH 7.0，充分混匀，冰浴 30～60 min。

3. 加 10 ml 甘油，混匀。如果后续实验在当天进行，可保持在冰浴中，否则 - 70℃保存。

4. 临实验前加入 20 μl 100 mmol/L 乙酸充分混匀，30℃ 水浴，5 min。保存于冰浴中，直到进行下一步操作。

5. 每个分析反应按以下比例将各反应组分加入 1.5 ml 微量离心管中：

4 μl 5 × 酪氨酸激酶反应缓冲液

1 μl 酸变性的烯醇化酶（烯醇酶含量为 2. 5 μg）

1 μl [γ-³²P] ATP 溶液（ATP 终浓度为 5 μmol/L，放射活性为 5 μCi/μl）

0～14 μl 水

盖好离心管，30℃ 水浴，10 min。加入水的量取决于加入酶样品的多少。每个反应的容积为 20 μl。

6. 加入 1～14 μl 有酪氨酸激酶活性的酶样品开始反应。

7. 30℃ 水浴温育 10 min。

8. 加入 20 μl 预冷的 2 × SDS-PAGE 样品缓冲液停止反应，充分混匀，沸水浴 3 min，取 20 μl 进行 SDS-PAGE 电泳分析。

1. 酸变性的烯醇酶在冰浴中不要超过 1 h。

2. 步骤 6 中加入酶量的容积取决于样品中酶活性的大小。在预试验中所得的最大反应值可衡量磷酸转移反应的程度。在反应中为了保持磷酸基与底物的线性结合关系可适当减小酶的加量。