酵母剪接体分析实验（一）

实验方法原理 前接体是真核细胞核内剪接 mRNA 前体的大分子核糖核蛋白复合体，它由 5 种 snRNP 和大量的非 snRNP 蛋白组成，每一种 snRNP 由一个 snRNA 和几种蛋白质构成。

试剂、试剂盒 Tris HCI 溶液EDTATE乙酸钠SDSRNA 的匀浆缓冲液RNA 的溶解缓冲液Tris 碱Tris EDTA 平衡苯酚乙醇硅烷化溶液TPM8 缓冲液mRNAHEPES-KOHR 缓冲液上样缓冲液去离子甲酰胺Northern 印迹杂交液

仪器、耗材 液氮 离心机匀浆器旋转真空浓缩仪试管离心管玻璃板聚四氟乙烯垫片梳子黄色胶带电泳槽电源平头毛细管吸头滤纸

实验步骤

一、材料与设备

1. 从鼠组织中制备竞争性 RNA

除非另有说明，所有溶液都用无菌蒸馏水配制。

(1) DEPC 处埋水。

(2) Tris HCI 溶液：1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，0.1 mol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )。1 mol/L Tris-HCl 配好后，高压灭菌，室温保存，0.1 mol/L 的 Tris-HCl 由 1 mol/L Tris-HCl 溶液加无菌水稀释而成。

(3) 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)。

(4) 1X TE：10 mmol/L Tris-HCI ( pH 7.6 )，1 mmoI/L EDTA。

(5) 1 mol/L MgCl2 及 0.1 mol/L MgCl2 配好后灭菌，保存于室温，0.1 mol/L MgCl2 分成 500~1000 μl 每份，于 -20℃ 保存。

(6) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.4)。

(7) 10% （m/V）SDS。

(8) 用于制备竞争性 RNA 的匀浆缓冲液：3 mol/L LiCl，6 mol/L 尿素，20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4），10 mmol/L MgCl2。500 ml 的缓冲液可供从 16 只老鼠的组织中提取用 RNA 。用 DEPC  处理水配制，不能高压灭菌，制备后 24 内使用。4°C 保存。

(9) 用于制备竞争性 RNA 的溶解缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，1 mmol/L EDTA，1%（m/V）SDS。无菌条件下，室温可保存几天。

(10) 1 mol/L Tris 碱，灭菌后室温保存。

(11) Tris/EDTA 平衡苯酚，4℃ 可保存 1~2 天。长期储存应于 -20℃。当有机相变成淡橙色时应弃用。

(12) 氯仿 : 异戊醇（24 : 1)，磨口瓶中于室温保存。

(13) 7.5 mol/L 乙酸铵，配制好后，用 0.2 μm 孔径的滤器过滤除菌，4°C 保存。

(14) 70% 乙醇，室温保存。

2. 剪接体分析用溶液

(1) 硅烷化溶液：溶于氯仿中的 15% 二氯二甲硅烷，用带磨口塞的玻璃瓶在通风橱中保存。

(2) 1 mol/L 乙酸镁，配好后用 0.2 μm 孔径的滤器过滤除菌，于 4°C 保存。

(3) 17 X TP8 缓冲液，即 850 mmol/L Tris-磷酸，将 108 g Tris 碱和 20.0 ml 85% 磷酸 (分析纯）加入 800 ml 无菌水中，然后加水至 1 L。在 0℃ 的 pH 应该为 8.0，灭菌后 4℃ 保存。

(4) TPM8 缓冲液：50 mmol/L Tris-磷酸，在 0℃ pH 为 8.0，1.5 mmol/L 乙酸镁。

(5) 20% ( m/V ) 丙烯酰胺（丙烯酰胺：甲双叉丙烯酰胺）50：1：用一次性 0.2 μm 孔径的滤器过滤，在无菌、带螺盖的瓶中于 4℃ 可保存 1 年。

(6) 10% 过硫酸铵（APS）和 TEMED。

(7) 酵母完整细胞剪接提取物。

(8) 放射性标记的前体 mRNA：放射性标记的肌动蛋白前体 mRNA 可以在体外以克隆的肌动蛋白 DNA 并经 HpaⅡ 内切酶消化的产物为模板转录得到。肌动蛋白前体 mRNA 有 92 nt 的外显子 1309 nt 的内含子和 48 nt 的外显子 2。以 40000~80000 cpm/μl 溶于水中，-20℃ 保存。

(9) 磷酸钾缓冲液 pH 7.6：为制备 1 mol/L 的磷酸钾储存缓冲液，将 8.85 g KH2PO4 和 75.8 g K2HPO4 溶于 400 ml 水中，调整其 pH 为 7.6，然后加水补充至 500 ml，灭菌后室温保存。0.1 mol/L 的磷酸钾缓冲液由 1 mol/L 的磷酸钾稀释 10 倍而成，分成 500~1000 μl 每份，-20℃ 保存。

(10) 100 mmol/L ATP：500 mg ATP 溶于 5 ml 水中，先用 5 mol/L 再用 1 mol/L 的 NaOH 把 pH 小心的调至 6.8~7.2。100 mmol/L 的 ATP 由母液用无菌水稀释而成，分成 200~500 μl 每份，于 -20℃ 保存。用前于 37℃ 水浴迅速融化，置冰上使用。

(11) 30% ( m/V ) PEG8000：称取 30 g PEG8000 加入 65~70 ml 温水（50℃ ) 中，若需要，边加热边搅拌使其溶解。溶液冷却后，加水补充至 100 ml，灭菌。分成 1 ml 或 10 ml 每份，-20℃ 保存。

(12) 1 mol/L HEPES-KOH（pH 7.4）：用 0.2 μm 孔径的滤器过滤除菌，于 -20℃ 保存。

(13) R 缓冲液：50 mmol/L HEPES-KOH ( pH 7.4 )，2 mmol/L 乙酸镁。1 ml 每份于 -20℃ 或 -70℃ 保存。

(14) 含竞争性 RNA 的 R 缓冲液：对于 7.5 μl 的剪接反应，应有 7.5 μl R 缓冲液和 15 μg 竞争性 RNA ( 溶于 0.5~1 μl )。在剪接体分析前混合 R 缓冲液和竞争性 RNA。

(15) 染料液：10%（m/V）溴酚蓝和二甲苯蓝。

(16) 上样缓冲液：217 mmol/L Tris-磷酸，0°C 时 pH 8.0，40% ( V/V ) 甘油，各 0.25% ( m/V ) 的溴酚蓝和二甲苯蓝，加 2.5 ml 17X TP8 缓冲液、2.5 ml 灭菌的甘油和 250 μl 染液到 4.75 ml 水中。分成 1 ml 每份，-20℃ 保存。

(17) 15% ( V/V ) 甲醇，5%（V/V）乙酸。螺口瓶中于室温保存。

3. 内源性 snRNP Northern 杂交分析用溶液

(1) 10X TBE：890 mmol/L Tris-硼酸，25 mmol/L EDTA ( pH 8.3 )。室温保存。

(2) 1 XTBE，8 mol/L 尿素：89 mmol/L Tris-硼酸（pH 8.3)，2.5 mmol/L EDTA，8 mol/L 尿素。

(3) 0.25XTBE：由 10XTBE 用去离水稀释而成。

(4) 20X SSCP：2.4 mol/L NaCl，0.3 mol/L 柠檬酸钠，0.40 mol/L 磷酸钠（pH 7.0)。室温存放。

(5) 去离子甲酰胺。

(6) 50X Denhardt 溶液：1%（m/V）水溶性聚庶搪 ( Ficoll，平均分子质量为 400000 Da )，1% ( m/V ) 聚乙烯吡咯烷酮（平均分子质量为 40000Da)，1% ( m/V）BSA。用 0.45 μm 孔径的一次性滤器过滤后分成 20~50 ml 每份，于 -20℃ 保存。

(7) 单链鲑鱼精 DNA (ssDNA )，10 mg/ml：在 1XTE 中溶解双链鲑鱼精 DNA 50 μg/μl。超声处理以剪切 DNA，使之断裂为 300 bp 的片段（用琼脂糖凝胶电泳分析）。煮沸迅速冷却，然后用 TE 稀释到 10 μg/μl，分装后于 -20°C 保存。

(8) Northern 印迹杂交液：50% ( m/V）甲酰胺，0.1%（m/V）SDS，5X SSCP，3X Denhardt 溶液，100 μg/ml ssDNA。-20℃ 保存，用前加热到 60~65°C。

(9) 50 mmol/L EDTA（pH 8.0)，0.1 % ( m/V ) SDS。

(10) 放射性标记的探针：在本实验中，用 snRNA 基因的双链 DNA 片段来制备 Northern 杂交用探针。该 DNA 片段可以从克隆的 DNA 用内切酶消化并用琼脂糖凝胶电泳纯化而得来，也可以用 PCR 扩增的方法制备。snRNA 基因的 DNA 片段长度范围为 200~1300 bp。DNA 片段经随机 6 聚脱氧寡核苷酸引物反应被放射性标记，用 Klenow 聚合酶和放射性核苷酸（2.5 μl [ α-32P ] dATP，为 3000 Ci/mmol，10 mCi/ml )，25 μl 反应体系。加入 225 μl 50 mmol/L EDTA，0.1% SDS 终止反应。探针在 100°C 加热 10 min 变性后立即加入到 15 ml 65°C 的杂交液中。

(11) 3X Northern 印迹洗涤缓冲液：3X SSCP，0.1% SDS。

(12) 0.1X Norhern 印迹洗涤缓冲液： 0.1X SSCP，0.1% SDS。