实验概要
本实验将在构建了大蒜重金属抗性基因表达载体并转入大肠杆菌DH5α的基础上,选择鉴定准确的质粒转化酵母细胞,对转化子进行了PCR鉴定和RT-PCR分析,及重金属抗性实验。
主要试剂
YPD培养基,醋酸锂,PEG(50%),乙醇,少量酵母菌总RNA快速抽提试剂盒
主要设备
摇床,离心机,水浴锅,PCR仪,电泳装置
实验材料
重组大肠杆菌DH5α(含大蒜重金属抗性基因的克隆)
实验步骤
1 酵母转化
1) 接种5 ml液体YPD,30℃下振荡培养过夜;
2) 计数过夜培养物细胞密度。以最终5X106/ml的细胞密度接种100 ml YPD培养基;
3) 置30℃,200 rpm/min振荡培养至2 X 107/ml,通常需要3-5小时;
4) 用50 ml无菌离心管以3000 X g离心5 min,收获细胞;
5) 弃培养液,悬浮细胞于25 ml无菌水中,同上离心;
6) 弃水,把细胞悬浮在1 ml的100 mmol/L的醋酸锂中,转悬浮物到一个无菌1.5 ml的离心管中;
7) 离心5 sec沉淀细胞,吸出醋酸锂;
8) 悬浮细胞至终体积500 ul体积,其中大约含有400 ul的100 mmol/L醋酸锂;
9) 将1 ml单链单体DNA样品煮沸5分钟,快速在冰水中冷却;
10) 振荡细胞悬浮液,取50ul样品加到标记的离心管中,离心沉淀细胞,除去醋酸锂;
11) 按照下列成份配置“转化混合液”:
240 ul PEG(50%)
36 ul 1.0 mol/L醋酸锂
25 ul 单链载体DNA (2.0 mg/ml)
50 ul 水和质粒(0.1-10 ug)
12) 剧烈振荡每个反应管至细胞完全混匀,通常要1 min;
13) 30℃保温30 min;
14) 42℃热激20- 25 min;
15) 6000-8000 rpm/min离心15秒,除去转化混合液;
16) 吸0.2-1.0 ml无菌水加到每个反应管中,轻轻悬浮沉淀;
17) 用等份的200 ul转化混合液涂选择平板。
2. 转化子的筛选
转化的酵母菌株涂到缺Leu的SD培养基上,30℃培养72小时。挑取阳性克隆。对阳性克隆进行菌落PCR鉴定。
3. 酵母转化子的RT-PCR分析
根据少量酵母菌总RNA快速抽提试剂盒的说明书进行:
1) 将酵母菌(≤5 X 107)移入离心管中,离心10 sec,去上清。
2) 加入500 ul DY液,彻底振荡悬浮;
3) 加200 ul Lyticase混匀,30℃温育15-30 min,500 X g离心5 min,弃上清;
4) 加500 ul TCL液,立即盖盖,高速振荡5 min,12000 X g离心3 min,保存上清;
5) 加入上清的1/2体积的75%的乙醇,彻底混匀,移入吸附柱,离心30 sec弃滤液;
6) 加500 ul RP液,离心30 sec,弃滤液;
7) 加500 ul W3液,静置1 min,离心15 sec,弃滤液;
8) 离心1 min;
9) 加50 ul H2O,静置1 min;
10) 离心1 min。
4. 重金属抗性实验
1) 挑取转化的酵母单菌落于30℃培养酵母24-48 hr;
2) 调节酵母的浓度至OD值1.0,然后分别稀释10倍、100倍、1000倍后,各取2ul于含有不同浓度重金属离子的SD培养基(Leu)上。重金属浓度分别为:
Na3AsO4:0,100 umol/L,300 umol/L和500 umol/L,1000 umol/L
CdCl2:0,50 umol/L和100 umol/L},30℃培养72 hr ;
3) 观察结果。
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