酵母双杂交实验

实验概要

本实验构建了Bait载体和prey载体，酵母双杂交后，应用CPRG法定量测试了蛋白质相互作用。

实验步骤

1. Bait载体的构建

将高保真PCR扩增的OsCCTlb(引物为OsCCT1bEcoRI5'和OsCCTlbXhoI3')和OsCNTlb(引物为OsCNTlb   EcoRI5'和OsCNTlbXhoI3')基因片段用EcoRIlXhoI双酶切后连接入pLexA的EcoRI/XhoI位点。DNA测序正确后用于实验。

2. prey载体的构建

用高保真聚合酶扩增OsCRYlb(引物为OsCRYlbEcoRI5'和OsCCTlbXholI3')和OsCOPl缺失第1-162个氨基酸的片段OsCOPl⊿l-162(引物为OsCOP1487EcoRI5'和OsCOP1XhoI3')。PCR产物用EcoRIlXhoI双酶切后分别连接入pB42AD的EcoRI/XhoI和EcoRI/XhoI(平端)位点。DNA测序正确后使用。

3. 酵母双杂交

   1) 摇菌(准备转化用)

45mLYPD加5mL 20%葡萄糖(Glucose)。加入100uL EGY48酵母菌，摇一天。

   2) 转化(一步法)

      a. 取酵母菌液1.5mL于Eppendorf管中，12，000rpm离心1 min。

      b. 用枪吸尽上清液，加入one-step buffer 100微升。

      c. 吹打匀后加入到混合液(carrier DNA 6uL，pSHI18-34 5uL，bait 3uL，prey2.5uL)中，震荡混匀，45℃水浴30min。

      d. 涂板(生长培养基加Glucose加AA-His-Trp-Ura )，30℃放置3天左右。

   3) 挑克隆

每个样品挑10个于1mL液体生长培养基培养一天(30℃，220rpm )。

   4) 诱导

从摇出的菌液分别取100ul放入2mL诱导培养基中培养13小时左右，OD值大约为0.8到0.9。

   5) CPRG法定量测试蛋白质相互作用

      a. 取诱导出的菌液1mL，13，000rpm离心1 min，弃上清。

      b. 加入1 mL buffer 1，震荡混匀，离心1 min。

      c. 弃上清，留下大约100uL，震荡混匀。

      d. 液氮速冻1 min，放37℃水浴1 min，然后再放液氮1 min，放37℃水浴1 min。

      e. 加入900uL buffer2(这里开始计时)，震荡混匀，离心1 min，取出上清加入到比色杯中。

      f. 计时到l0min分钟时加入0.5 mL 3 mM的ZnC1₂，吹打均匀。

      g. 测其OD值(578nm)和菌液OD值(600nm)。

得出的数值套入公式：Units=1000xOD578/elapsed time (min) x Volume (mL) x OD₆₀₀即可计算出两蛋白相互作用值。

注意事项

在本实验中，由于本底非常高，所以在进行CPRG法测试前将所有菌液稀释10倍后再做分析。