酵母基因组DNA的玻珠制备法

实验概要

本实验利用玻珠制备法制备了酵母基因组DNA。

主要试剂

无菌水，裂解缓冲液，5mol/L NaCl，苯酚，氯仿：已戊醇(24：1)，乙醇，TE缓冲液，EDTA-Sark，蛋白酶K，5mol/L醋酸铵

主要设备

摇床，玻璃离心管，台式离心机，玻珠，振荡器，P-1000移液器，1.5ml离心管

实验步骤

1．用5ml培养基在30℃下，摇床培养过夜。

2．转移培养物至13mm×100mm的玻璃离心管中，用台式离心机以1500r/min离心5分钟，收集细胞。

3．用3ml无菌水洗细胞，同上离心。

4．用500μl裂解缓冲液再次悬浮。

5．加入干净玻珠(约1.5ml Eppendorf离心管的2/3体积)和25μl的5mol/L NaCl。

6．以最高速振荡1分钟。

7．用2000r/min离心2分钟。

8．用P-1000移液器转移上清液至一支1.5ml的离心管。

9．加入500μl苯酚，振荡，离心1分钟。用P-1000移液器吸取水相，转移至洁净离心管，加入500μl SEVAG(氯仿：已戊醇，24：1)，同上振荡，离心，抽提。

10．加入1ml的95％的冷冻乙醇，在-20℃下沉淀1小时。

11．以最高转速离心沉淀DNA，弃上清液，用70％乙醇清洗，最后悬浮在250μl TE缓冲液中。

12．加25μl的EDTA-Sark和5μl的蛋白酶K(10mg/ml)，置37℃保温30分钟。

13．加250μl的5mol/L醋酸铵，重复9、10步骤。

14．收集DNA，用70％乙醇洗，悬浮于100μl的TE缓冲液。