酵母细胞核制备

实验材料 酵母菌

试剂、试剂盒 细胞核缓冲液Ficoll缓冲液

仪器、耗材 匀浆机

实验步骤

1.  将酵母菌接种于YPD培养基（100 ml 到20 L），剧烈摇动或强制通气条件下培养至对数中期（OD600≈1~5）。培养物在预称重的离心瓶中于4℃， 1 500 g 离心5 min。
 
2.  确定酵母细胞的湿重，它与压紧的细胞体积大致相同。在所有的后续步骤中菌体的量将当作1体积来考虑。
 
3.  细胞用2~4体积冰水重悬，并立即于4℃，1 500 g 离心5 min，加入1体积含30 mmol/l DTT的酵母消解酶缓冲液重悬细胞、室温放置15 min。

4.  于4℃，1 500 g 离心5 min，菌体用3体积的酵母消解酶缓冲液重悬。
 
5.  在每毫升原压紧细胞中加入2 mg（200 U）酵母消解酶-100T，于30℃水平摇床以大约50 r/min 的转速温育40 min，通过水渗破法确定菌体是否完全转变为原生质体，如果原生质体化不完全，应继续温育直到完全。
 
6.  1 500 g 离心原生质体5 min，小心弃上清，原生质体球沉淀块不如细胞沉淀块般紧密。
 
7.  用2体积冰冷的酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，原生质体1 500 g 离心5 min，重复2次。

8.  用0.5体积的细胞核缓冲液重悬细胞。

9.  将细胞悬液逐滴加入盛有15~25体积冰冷的Ficoll缓冲液的烧杯中，此过程在冰浴或冷室中进行，不断地振荡。
 
10.  将悬浮液转移到离心管中，于4℃，3 000 g 离心5 min，如果要完全除去细胞碎片， 重复离心几次。
 
11.  将上清转移至一个新的离心管中，于4℃12 000 g 离心20 min，沉淀用5~10倍体积的细胞核缓冲液重悬；再于4℃，12 000 g 离心。
 
12.  为了获得细胞胞核裂解液，用1体积裂解缓冲液重悬细胞核沉淀。

13.  用2体枳酵母消解酶缓冲液轻轻重悬沉淀，不要试图得到均一的悬液，只需将沉淀物从管壁上洗下来，悬转10~20次，于1 500 g 离心10 min 回收原生质体。

14.  用玻璃棒仔细将原生质体沉淀重悬于1体积裂解缓冲液中。
 
15.  在Dounce 匀浆器中用最紧密的研杵，冲击15~20次以裂解原生质体。

16.  往超离心管中加入一半管体积原生质体裂解液，再加等体积的抽提缓冲液，将离心管封口。于4℃在旋转轮或摇床上轻轻倒转离心管15~30 min。

17.  于4℃，45Ti转子上100 000 g 离心90 min。收集上清，在100体积贮存缓冲液中透析2 ~ 4 h。将透析袋转移到100体积新鲜的贮存缓冲液中，再透析2~4 h。
 
18.  取出几微升透析液，用水作1 ：1 000稀释，测定电导率。如果和类似稀释度的贮存缓冲液相等或低于一定值时（通常100~250 mmol/l NaCl），继续步骤19，否则继续透析。
 
19.  于4℃，10 000 g 离心10 min。收集透析液上清。分成小份放在液氮中冷冻，于 -80℃贮存。