酶标仪利用”无创”技术检测活细胞荧光蛋白（一）

简介

在过去的五年中，荧光蛋白在监测体内生物学研究中，起到越来越重要的作用。源于维多利亚多管发光水母中的绿色荧光蛋白(GFP)是最早被我们应用的荧光蛋白，但是随着时间的推移，现在我们可以使用的荧光蛋白种类也越加丰富，包括加强型的变异GFP蛋白、从其他种类水母中发现的荧光蛋白和珊瑚礁蛋白。它们都可以在众多的细胞和组织中被克隆复制，从细菌到酵母，从植物到哺乳动物。这些荧光蛋白稳定、细胞毒性小、而且不需要额外的辅助也能在体内产生可见的荧光。因此，它们可以被用作分子靶标或者独立的报告因子去视化、追踪和定量多种不同的细胞进程，包括细胞合成与代谢，蛋白转运，基因诱导和细胞谱系。不同的荧光蛋白具有不同的颜色，因此也可被用于多重检测。这些荧光蛋白都能被荧光显微镜和流式细胞仪检测到。但是相应的，如果我们不做细胞分选或监测细胞内迁移，微孔板荧光读板仪将是一个更好、更方便和更高通量的检测系统。下面，我们将会向大家展示Molecular Devices酶标仪如何利用”无创”技术检测活细胞荧光蛋白。

我们将从BD Biosciences Clontech公司获得的三株HEK-293细胞系进行不同荧光蛋白的稳定转染。这次研究的目的：1）优化三株细胞系的波长设置，2）通过稀释细胞系来确定检测下限LLD，3）证明在一种细胞系中识别另一种细胞系的可行性。

材料：

HEK-293细胞系稳定表达三种荧光蛋白：

AcGFP---多管发光水母中产生的另一种GFP(但不同于维多利亚水母)

ZsGreen---与GFP相似，但更亮(来自珊瑚礁)

DsRed---一种来自珊瑚礁的红色荧光蛋白非转染的HEK-293细胞系，作为对照

方法：

细胞准备与分析

细胞都培养在大烧瓶中，应用含10% FBS+ 1% Pen/Strep/L-glutamine +500 μg/mL G 418的DMEM的培养基。没有转染的HEK-297细胞作为对照。在实验前一夜，对细胞进行胰酶消化，然后进行密度梯度稀释，最终密度范围为从500,000到100个细胞每毫升。然后把它们过夜接种到96孔(100ul)和384孔(25ul)板中。因此，接种的细胞密度就是50,000到10个细胞每孔(96孔板)和12,500到2.5个细胞每孔(384孔板)。每个稀释都做12个重复。第二天分别用SpectraMax M5和Gemini EM两台仪器对酶标板进行底读和顶读检测。

波长优化

SpectraMax M5和Gemini EM都是基于单色器的扫描式荧光读板仪。针对每一个特殊荧光染料，其激发波长和发射波长都可以在背景之上进行信号优化，这点也是滤光片式酶标仪所不具备的。总的来说，优化策略就是：用低于理论最大激发波长20-25nm的激发光激发，然后初扫发射波长；其次用高于理论最大发射波长20-25nm的发射光扫激发波长。扫描后将给出实际的激发与发射波长。最后可以结合信号/背景分析再做其他额外的扫描来确定最终的结果。（根据斯托克顿位移理论，激发波长应该更低、发射波长应该更高，并且需要一个发射光阻隔滤片来隔离掉非目的波长的光信号）。而且可能还会因为要选择最佳阻隔滤片而再进行两次扫描。

结果：

波长优化

用Gemini EM对DsRed进行波长扫描，以此举例如何进行波长优化。为了检测最大激发波长， 我们首先固定发射波长为600nm，然后对发射波长进行扫描。扫描结果显示最大激发波长为556nm。(图1)同样为了检测最大发射波长，我们固定激发波长为535nm，然后扫描发射波长，从而得到584nm的结果。(图2)激发与发射值都与被发表的波长结果557/579相近。