酶标仪利用”无创”技术检测活细胞荧光蛋白（二）

下一步就是要结合信号/背景优化结果确定最佳激发和发射波长。因为初步检测结果的斯托克顿位移偏小(22nm)，显然是要通过降低激发波长和增大发射波长来扩大两者之间的差异，其次还需要找到合适的发射光阻隔滤片优化最佳灵敏度。最终，我们使用5 5 0nm的激发波长来激发， 同时使用570nm的发射光阻隔滤片隔离掉不想要的高于570nm以上的激发光。通过575到600nm的发射波长扫描DsRed转染的细胞，结果显示在587-588nm处会有峰值出现(图3，上面的曲线)。背景(没有转染的细胞)区域中，点就相对比较平缓(图3，下面的曲线)。基于本次扫描，我们最终优化的设置为550nm激发、588nm发射、575nm作为发射光阻隔滤片。

观察到的最大值与我们建议用于定性分析的设置都总结在列表1中。

 

 

细胞稀释的结果

采用底读得到的细胞稀释结果详见图4(96孔板)和图5(384孔板)。顶读结果详见图6(96孔板)和图7(384孔板)。ZsGreen细胞系(上面的曲线)的亮度是其它两种细胞系的将近3.5倍。尽管DsRed细胞系的结果暗于ZsGreen，但两种细胞系的检测灵敏度却相近。(列表2的下图)，因为背景值低于DsRed的波长。

 

总的来说，图中的点稍微有些非线性，最上方会有一点下降。我们推断是因为细胞在高浓度时，会有贴壁生长的趋势，所以会造成非线性的结果。列表2给出了所有细胞系确认得到的检测下限L L D 。其中L L D 的计算方法是：3SDBLANK/Slope，SDBLANK是背景孔(没有细胞的培养基)的标准差，Slope是曲线底部的斜率。(对于96孔板和384孔板，分别使用了10,000个细胞每孔和2500个细胞每孔的数据)。非转染细胞的RFU信号和标准差结果都与只含有培养基的结果相似。