酶标仪在植物领域的三种应用总结（一）

一、简介 

在基于哺乳动物细胞的研究中，酶标仪主要应用于: (1) 常规分子检测，如核酸、蛋白浓度及酶活性分析等；(2) 信号转导研究， 如一些细胞信号事件如 ROS，修饰的检测；(3) 整体细胞水平的分析，如细胞的活力、凋亡和杀伤等。然而在植物领域中，酶标 仪的应用则偏向前两个方向，此外，植物领域的酶标仪应用普遍度也不及动物，但这并不限制酶标仪在该领域的应用前景。在此， 我们结合常见的应用案例介绍酶标仪在植物领域中的应用，提升酶标仪在植物研究中的应用价值，并进一步协助植物的科研发展。 

二、利用酶标仪进行常见的分子检测和分析 

在植物领域中一些基础的分子检测，如基于紫外吸收或荧光的 DNA，RNA 和蛋白定量及纯度分析等，都可以用酶标仪进行 高通量检测。由于原理和应用类型与研究哺乳动物细胞类似，在此就不赘述了，大家有需求可参考我们针对核酸定量的应用材料。 在此我们主要列植物领域中比较特色的几个案例。 

2.1 吸收峰和荧光光谱分析 

植物领域中通常会涉及到对一些感兴趣的化合物，如色素等的物理指标分析，其中就包括吸收峰分析和针对具有荧光特质的 化合物进行荧光光谱分析。通常这些分析会由分光光度计完成，但会受到通量和曲线分析能力的限制。现阶段大部分 Molecular Devices 推出的配备光栅的酶标仪如 M 系列和 iD 系列都支持出色的光谱扫描分析，包括全波长光吸收和荧光光谱扫描，步进可精 确至 1 nm，可应对常见的光谱分析需求，并极大提高通量。同时配备的 SoftMax Pro 软件可自动分析光谱图简化处理流程。

基于光谱扫描还可用于进一步分析具有调节荧光能力的蛋白功能，如蓝藻细菌中的 Orange Carotenoid Protein (OCP) 在强 蓝-绿光下会和藻胆 ( 蛋白 ) 体 (PBS) 相互作用来保护细胞。实验中可观察到 OCP 的引入可降低 PBS 的荧光发射强度。对于新发现 的 OCP 家族成员，我们就可以通过荧光光谱扫描功能确认其是否会淬灭 PBS 的荧光 ( 图一 )。结果发现相较于已知的 OCP1，新 发现的 OCP2 具有较弱的荧光淬灭能力 ( 图一，来源于文献 Nat Plants. 2017 Jul 10;3:17089. )。

^{图一 分析 OCP 的 PBS 荧光淬灭能力，黑色实线代表无强蓝-绿光照射下 PBS 的荧光发射谱 ( 激发 580 nm )，黑色虚线代 表在强蓝-绿光照射下 PBS 的荧光发射谱。蓝色和红色虚线分别代表在在强蓝-绿光引入 OCP1 和 OCP2 。 图片来源于文献：Nat Plants. 2017 Jul 10;3:17089.。酶标仪为 SpectraMax M2。}

2.2 酶活分析

在植物研究中，酶活分析也是常见的检测之一，主要用于探究植物本身酶的功能和植物提取物对各种酶活性的影响。基于底 物工作机制的不同，酶活可用光吸收法和荧光法检测。例如图二就展示了多种植物的提取物对参与血糖调控的 α-淀粉酶 (α-amylase) 和 α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase) 活力的抑制 ( 来源于文献：J Agric Food Chem. 2012 Sep 12;60(36):8924-9.)。其中，α-淀粉酶 的活力检测是基于使用自身淬灭的 DQ™ starch 荧光底物。随着底物在酶的作用下发生降解，进而发出荧光，并可通过荧光强度 的变化分析酶活。而 α-葡萄糖苷酶活性的检测则基于其底物光吸收属性在酶处理下的变化。

^{图二 不同浓度植物提取物对 α-淀粉酶 ( 左 ) 和 α-葡萄糖苷酶 ( 右 ) 活力的抑制。图片来源于文献：J Agric Food Chem. 2012 Sep 12;60(36):8924-9.。酶标仪为 SpectraMax Gemini ( 荧光检测 ) 和 SpectraMax 190 ( 光吸收检测 )}

通常，酶活检测基于动力学检测模式，同时需要进行控温。多数 Molecular Devices 推出的酶标仪均可完成酶活检测。除此 之外，配备的 SoftMax Pro 软件支持工作流，可进行复杂的酶活设定和检测，同时对动力学的多种分析，如斜率，最高速度，曲 线下面积等，都可轻松用软件批量分析。

2.3 DPPH 和 ORAC 分析

DPPH 和 ORAC 分析是抗氧化研究中常见的两个检测项目，常被用于分析植物和中药提取物的抗氧化能力。其中 DPPH ( 1,1二苯基-2-三硝基苯肼 )自由基清除实验基于带有自由基的 DPPH 和中和后的 DPPH 具有不同的光吸收属性进行分析待测物质是否 具有自由基清除能力 ( 图三 )。

^{图三 DPPH 工作原理，图片来源于网址：https://www.omicsonline.org/articles-images/2161-0444-4-517-g001.html}

因此，配备光吸收功能的酶标仪就可用于检测 517 nm 附近的吸收强度变化，进而推测待测样本的自由基清除能力。图四展 示了不同的类胡萝卜素的抗氧化能力比较 (Sci Rep. 2016 Feb 23;6:21987.)。

^{图四 基于 DPPH 自由基清除实验比较不同类胡萝卜素的抗氧化能力， 图片来源于文献：Sci Rep. 2016 Feb 23;6:21987.。酶标仪为 SpectraMax Plus384。}

ORAC 实验则是检测氧化自由基吸收能力 (Oxygen Radical Absorbance Capacity)，与 DPPH 不同，其基于荧光法。体系中 引入的自由基产生者 AAPH (2,2’-azobis (2-amidino-propane) dihydrochloride) 会破坏荧光探针，使荧光强度逐渐衰退。而引 入的具有抗氧化能力的待测样本则会抑制荧光强度的衰退，进而通过计算荧光动态曲线的曲线下面积 (AUC) 的变化可分析待测化 合物的抗氧化能力 ( 图五 )。一般，ORAC 实验中会用 Trolox 标准品作为校准，获得不同待测样本的抗氧化指数 ( 图五， Molecules. 2013 Oct 17;18(10):12937-50. )。

^{图五 利用 ORAC 实验分析不同草药提取物的抗氧化能力。左图为荧光动力学曲线，可观察到草药提取物的引入增加 了荧光探针的信号寿命 ( 曲线下面积 )。右图为参考 Trolox 结果得出抗氧化指数。图片来源于文献：Molecules. 2013 Oct 17;18(10):12937-50.。酶标仪为 SpectraMax Gemini}