酶标仪在植物领域的三种应用总结（二）

三、利用酶标仪进行植物信号分析

除了一些常见分子的分析和定量之外，常见的植物信号，如报告基因、蛋白蛋白相互作用和 ROS 分析等，也都可以用酶标仪 进行高通量的分析。

3.1 报告基因分析

基于 β-葡萄苷酸酶 (β-glucuronidase) 的 GUS报告基因系统利用了在高等植物中 β-glucuronidase 表达和活性很低，是常见 的研究植物基因功能和活力的分析方法。基于不同的底物，GUS 报告基因可用多种方法学进行检测，包括组织染色法、光吸收法 和荧光法。在此主要介绍可用于荧光酶标仪分析的荧光法，其主要基于底物 MUG (4-methylumbelliferyl b-D-glucuronide)，其 在 GUS 的作用下产生具有荧光的 4-MU (4-methylumbelliferone)，可以进一步用荧光酶标仪进行分析。在进行荧光法 GUS 报告 基因检测时，通常需要 4-MU 标准品进行校准，同时 GUS 的活性还需要进一步使用总蛋白量来校准。此外，4-MU 本身容易降解， 因此使用时注意保护和有效期。

荧光法 GUS 报告基因系统在植物研究中的应用方向很多，其中包括特定的基因启动子活力在激素处理和压力情况下的变化 ( 图六，J Exp Bot. 2005  Mar;56(413):909-20. ) 和特定基因的过表达是否会影响靶基因启动子活力 ( 图七，Mol Plant. 2012 Sep;5 (5):1042-57. ) 等。 

^{图六 利用 GUS 报告基因检测不同激素 ( 上图 ) 和压力 ( 下图 )情况下基因启动子活力的变化。白框表示对照组，灰 线代表处理组。图片来源于文献：J Exp Bot. 2005  Mar;56(413):909-20.。酶标仪为 SpectraMax Gemini}

^{图七 利用 GUS 报告基因检测 RAP2.11 过表达对 AtHAK5 启动子活力的影响。 图片来源于文献：Mol Plant. 2012 Sep;5(5):1042-57.。酶标仪为 SpectraMax Gemini}

3.2 蛋白蛋白相互作用分析

信号转导研究中蛋白之间的相互作用 (Protein-Protein interaction，PPI) 分析是关键的一环，植物研究也不例外。现阶段， 研究植物体内体外的PPI的方式有很多种，包括免疫共沉淀、FRET等。在这我们主要介绍利用酶标仪的两个方法：基于荧光的 bimolecular fluorescence complementation (BiFC) 和基于化学发光的 Split luciferase complementation assay (SLC)。

BIFC 是基于对荧光探针如 GFP、YFP 的 N,C 端拆分并分别和需研究的 PPI 成员克隆在一起。存在相互作用的情况下，探针的 N,C 端接近，具有荧光属性 ( 图八 )。此时就可用荧光酶标仪高通量分析是否存在 PPI。BIFC 的优势是检测体内的PPI存在，同时 结合荧光显微镜还可分析PPI发生的位置 ( 图九，Plant Cell. 2014 Mar;26(3):1345-59. )。

^{图八 BIFC 原理，图片来源于网址：https://commons.wikimedia.org/wiki/file:BiFC_(details).png}

^{图九 BIFC 应用案例，左图为荧光显微镜分析结果，右图为对应的酶标仪检测结果 ( 36 份独立样本 )， 图片来源于文献：Plant Cell. 2014 Mar;26(3):1345-59. 酶标仪为：SpectraMax M5}

SLC 则是基于敏感的化学发光反应，原理和 BIFC 类似，不过不是拆分荧光探针，而是荧光素酶 ( luciferase，图十，上 )。 PPI 发生时，荧光素酶的 N,C 端接近，此时结合引入的底物就可以进行化学发光反应，获得的光信号就可以用酶标仪分析( 图十，中，下 (Plant J. 2007 Oct;52(1):185-95.；Mol Cell.2018 Feb 1;69(3):493-504.e6. )。由于是化学发光检测，SLC 不受植物自发荧 光的干扰，同时也更为灵敏，缺点是无法直观检测 PPI 发生位置。

^{图十 上，SLC 原理，中，SLC 检测流程，下，利用 SLC 检测候选蛋白之间的相互作用，以及免疫系统的激活对相互 作用的影响。上图和中图来源于文献：Plant J. 2007 Oct;52(1):185-95.。下图来源于文献：Mol Cell.2018 Feb 1;69 (3):493-504.e6. 酶标仪为配备化学发光功能的 SpectraMax 系列}