酶标法测定碳水化合物含量

实验概要

在真核和原核生物中，糖不仅是重要的能源和结构成分，而且是控制生理、代谢、细胞周期、发育和基因表达的中心调节分子。在高等植物中，糖影响生长和发育的整个生命过程，从种子萌发到开花直至最后衰老。越来越多的证据表明糖作为生理信号，调节着植物基本生理过程的许多基因的表达，包括光合作用、乙醛酸代谢、呼吸作用、淀粉和蔗糖的合成及降解、氮的固定作用、储藏蛋白的合成、病原防御、损伤反应、细胞周期的调节、色素的合成以及衰老反应。本实验用酶标法测定了拟南芥碳水化合物含量。

实验原理

1 mol的己糖经过酶反应，最终转化称6-Phosphogluconat均伴随着1 mo1NADPH的产生，通过测定NADPH在340nm的光吸收，即可测定样品中的己糖含量。

主要试剂

1. 溶液的配制

1mM glucose

1mM fructose

1mM sucrose

500mM TRA buffer pH 7.4   TRA=triethanol amino

2M MgSO₄

200 mM ATP

200mM NADP

以上的溶液均需于-20^oC保存

Acetate buffer 0.1 M，pH 4.6

10ml 1N acetic acid(醋酸) 5m1 1N NaOH，加dd H₂0至90m1，调pH至4.6，定容至100mI。

2. 反应混合液(testmix)的配制((1 ml可点96孔，可根据需要配制一定体积，尽量少，因为酶价格较贵)

5ml TRA 500mM，pH 7.4(盐酸二乙醇胺溶于水，1 N NaOH调pH 7.4)

15ul MgS0₄(2M)

100ul ATP(200mM)

100ul NADP (200mM)

10ul Glucose-6-phosphat Dehydrogenase(G6P-DH，Grad II，140U/ mg)

3. 各种酶的配制

Hexokinase：用水1: 200稀释母液(母液浓度15000U/ml)

Phosphogluco-isomerase：用水1: 200稀释母液(母液配制:350U/mg10mg/ml)

Invertase：0.3mg干粉溶于1 ml醋酸缓冲液(pH4. 6，0.1 M)

Amyloglucosidase：6.09mg/ml (21.3U/mg)

实验步骤

1. 样品制备

    1) 用液氮收集植物材料，将材料用冷冻真空干燥仪充分干燥，将干燥后的材料1密封保存在-20^oC。

    2) 称取2-4mg干燥的材料与l0mg PVPP，lmg活性炭充分混匀，沸水浴20分钟，置于冰上冷却。

    3) 加入200ul重蒸水，充分研磨，室温放置25分钟。

    4) 10000rpm离心10分钟。吸取100u1上清液，进行可溶性糖的测定。

    5) 剩余部分加入100ul醋酸缓冲液(pH4.6 )，混匀后沸水浴15分钟，冷却至室温，加10ul amyloglucosidase充分混合，37^oC水浴保温过夜。

    6) 离心10min，取出100ul上清液，用作淀粉测定之用(可于-20 ^oC或-80 ^oC下保存备用)。

2. 酶标法测定

    1) 葡萄糖、果糖、蔗糖的测定

        a. 样品配制

按下表将各种成分混合

HG示空白对照，St为标准样品，sample为待测样品

        b. 点样

将样品按下表顺序点入96孔比色板

每个样品测3个重复。

        c. 测量

将比色板放入酶标仪读取数据，待读数稳定后记录。

取出比色板，将每个孔中加入稀释好的Hexokinase  10ul，放入酶标仪反应30分钟，其间每5分钟测量一次数据，将稳定后的数据记录。取出比色板，将每个孔中加入10ul稀释好的Phosphogluco-isomerase，放入酶标仪反应30分钟，其间每5分钟测量一次数据，将稳定后的数据记录。取出比色板，将每个孔中加入50ul稀释好的Invertase，放入酶标仪反应45分钟，将最后稳定的数据记录。

        d. 计算

记录的每组数据及相关的实验参数输入计算软件，即可得到各样品中3种糖的含量。

2) 淀粉的测定

        a. 样品配制

将经过Amyloglucosidase消化的样品按下表混合

根据样品淀粉含量的多少，水与样品的比例可适当调整在最后输入软件计算时，实验参数都应相应修改。

        b. 点样

方法同上

        c. 测量

将比色板放入酶标仪读取数据，待读数稳定后记录。取出比色板，将每个孔中加入稀释好的Hexokinase 10ul，放入酶标仪反应30分钟，其间每5分钟测量一次数据，将稳定后的数据记录。

        d. 计算

将记录的每组数据及相关的实验参数输入计算软件，即可得到各样品中淀粉的含量。