酶法检测磷酸化实验2

蛋白质磷酸酶和上面讨论的普通磷酸酶不同，它可在磷酸蛋白质底物的不同位点选择性脱磷酸化，因而可用于研究与蛋白质键合的特定磷酸基的功能性作用。

含 100 μg 总蛋白的样品

50 mmol／L Tris • Cl缓冲液 ／ 1 mmol／L 二硫苏糖醇(DTT)缓冲液 ／ 1 mmol／L MnCl2缓冲液(现配现用)Microcystin－LR蛋白质磷酸酶 2A(PP2A)

1. 100 μg 总蛋白溶于 100 μl Tris／DTT／MnCl2 缓冲液 pH 7.5，对照反应加 1 μl Microcystin-LR。37℃ 温育 10 min。

Microcystin－LR 是 PP1 和 PP2A 的有效抑制剂。

2. 加入 0. 2～0. 5 U PP2A，37℃ 温育 10～30 min。

1 U PP2A 或 PP1 在 30℃，pH 7.5，1 min 可水解 1 nmol 磷酸化酶 A。

3. 加入 Microcystin－LR 至终浓度 1 μmol／L 终止脱磷酸反应。

4. 用 SDS－PAGE 分析脱磷酸物或进行功能测定（见基本方案 1）。