酶联法检测人类免疫缺陷病毒HIV

实验概要

本实验用ELISA法检测了人类免疫缺陷病毒HIV。

实验原理

在微孔板上预包被高纯度基因重组HIV(1型加Ⅱ型)，与样品中抗HIV抗体反应，同时加入HRP标记HIV(1型加Ⅱ型)抗原。然后用TMB底物作用显色。通过酶标仪检测吸光度(OD值)从而判定样品中HIV抗体的存在与否。

主要试剂

1．预包被微孔反应板条

2．酶标试剂

3．阴性对照

4．阳性对照

5．洗涤液

6．显色剂A、B

主要设备

酶标仪或全自动酶联免疫检测仪。

实验材料

静脉抽血2ml，不抗凝

实验步骤

1．将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔，空白1孔。

2．每孔加人酶标试剂100ul，空白孔除外。

3．分别在相应孔中加入待测样品或阴性对照、阳性对照20ul，振荡混匀。37℃环境中温育60min。

4．弃去孔内液体，用洗涤液充分洗涤6遍，最后一次尽量拍干。

5．每孔加人显色剂A、B液各50u1，轻轻振荡混匀，置37℃环境中避光显色10min。

6．每孔加终止液50ul，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长450nm(建议用双波长检测)测定各孔吸光度。

7．结果判定样品OD值≥临界值(cut off)者为HIV抗体初筛阳性(注意：初筛阳性标本应重新取样品进行双孔复试，复试阳性者应按“全国HIV检测管理规范”送HIV确认实验室进行确认试验)。样品OD值<临界值(cutoff)者为HIV抗体阴性。

注意事项

1．检测单位必须是经当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。

2．检测必须符合HIV实验室管理规范和生物安全守则的规定，严格防止交叉污染。操作时必须戴手套、穿工作服，严格健全地执行消毒隔离制度。所有样品、洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理，终止液为2mol／L硫酸，使用时必须注意安全。

3．试剂盒从冷藏环境中取出同时应置室温环境中平衡30min后方可使用，未用完的微孔条密封保存。

4．加液时必须用加液器，并经常校对加液器的准确性。

5．洗涤时各孔均需加满洗涤液，防止孔内有游离酶不能洗净。使用洗板机洗涤应设定30～60s浸泡时间。

6．HIV抗体检测结果的判定必须以酶标仪读数为准，建议用双波长450／630nm检测。

7．操作应按说明书严格进行，不同批次试剂不得混用。

[临床意义] ELISA法HIVI型加Ⅱ型抗体阳性提示可能为HIV感染，但须经有关权威部门确认并须结合流行病学史和现病史诊断，同时送有国家认可资格的确认实验室进行确认。