酶联免疫吸附实验——抗体夹心ELISA法检测可溶性抗原

抗 体 夹 心 ELISA 法检测可溶性抗原

该检测方法比抗原直接结合到固相上的 ELISA 方法敏感性高 2〜5 倍（图 I.1. 3)。

附 加 材 料（其他材料见基本方案）

特 异 性 抗 体（单 克 隆 或 多 克 隆 ）或 者 来 自 抗 血 清 、腹 水 或 杂 交 瘤 上 清 液（单元1 . 4 ) 中 的 免疫球蛋白（单 元 1.5，单 元 1.7)。

1.用 PBSN 稀释特异性抗体或免疫球蛋白，配 制 包 被 抗 体 溶 液（最 终 浓 度 0.2〜10 ug/ml)

2.采用十字交叉连续稀释分析法，确定待检测抗原浓度所需的包被抗体和酶-抗体结合物 的 浓 度（见辅助方案），用 PBSN 配制此浓度的包被抗体溶液。

3.用 50 ul 包被抗体溶液包被 Immulon 滴定板，并 封 闭（见基本方案，步 骤 3〜5)。

4.用封闭缓冲液按 1 : 3 (v/ V ) 连 续 稀 释（见辅助方案） 同源抗原，配制标准抗原的系列稀释溶液。使 用 结 合 动 态 范 围 大（1 5 % 〜8 5 % ，总 范 围 是 0.1〜IOOOng 抗原/ml) 的稀释液。

虽然标准曲线对于精确测定待测样品中抗原量是必要的，但不需要用于定性
检测。

5.用封闭缓冲液配制待测抗原溶液的系列稀释度（通 常 是 1〜IOOng 抗原/ml)。如需要 ，测定待测抗原溶液 1〜2 个系列稀释度，确保至少一个稀释度可以精确测定。

6.抗 体 包 被 孔 中 加 入 待 测 抗 原 溶 液 或 标 准 抗 原 稀 释 液（步 骤 4)，室 温 下 孵 育 2 h以上。做 2 或 3 个复孔确保可精确定性测量，快速加入样品以最大限度减少因孵育时间不同造成的误差。

7.洗 涤 滴 定 板（见基本方案，步 骤 7)，加 入 50ul 碱性磷酸酶标记的特异性抗体（通常是 25〜400ng 特异抗体/ml)，室温下孵育 2 h。

8.洗涤滴定板，每孔中加人 75ul MUP 或 NPP 底物溶液，室温下孵育 lh ，用微量滴定板检测仪检测。如显色反应水平低，应在显色后数小时重新检测滴定板。

9.绘制基于标准抗原溶液连续稀释数据的标准曲线。抗原浓度对数值为轴 ，荧光度或吸光度为y轴 。用内插法，在标准曲线中求出待测溶液中抗原浓度。