采用改进的CTAB法提取细菌总DNA

实验概要

通过改进的CTAB法可快速简便的提取细菌总DNA，通过本实验可掌握CTAB法从细菌提取DNA的原理和方法。

实验原理

CTAB  (hexadecyltrimethylammonium  bromide，十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L   NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

主要试剂

2×CTAB提取缓冲液 [ 详细信息：100mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），20mmol/L EDTA，1.4mol/L NaCl，2%(w/v) CTAB，40mmol/L 巯基乙醇（随用随加）]

TE 缓冲液 [ 详细信息：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA ]

氯仿/异戊醇（24 /1）

酚/氯仿/异戊醇（24/25/1）

70%乙醇

蛋白酶K 20 mg/mL

10% SDS溶液

主要设备

冷冻高速离心机

台式高速离心机

移液器

水浴锅

锥形瓶

离心管 [ 详细信息：15mL和1.5mL]

小玻棒 [ 详细信息：形状为弯成钩状的 ]

实验材料

大肠杆菌

实验步骤

1. 从 LB 平板上挑取大肠杆菌单菌落接种至 4 mL LB 液体培养基中，振荡培养过夜（37℃，200 r/min）；培养物按 3% 接种量转接至含 25 mL 培养基的 250 mL 锥形瓶，培养至特定 OD600 值。

2. 挑取初生型单菌落，培养至稳定期，取菌液 3 mL，12000 r/min 高速离心 5 min，彻底去除上清液；

3. 加入 50 µL TE 缓冲液，充分悬浮细菌；

4. 加入 60 µL 10% SDS 溶液，10 µL 20 mg/mL 蛋白酶K，温和混匀，37℃温育 1 h；

5. 加入 100 µL 5 mol/L 的 NaCl 溶液，上下颠倒离心管十多次，充分混匀；

6. 加入 80 µL CTAB/NaCl 溶液，温和混匀，65℃下温育 10 min；

7. 加入 700 µL 氯仿/异戊醇，温和混匀，12000 r/min 高速离心 2 min；

8. 吸取上清至另一干净离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，12000 r/min 高速离心 2 min；

9. 吸取上清至另一干净离心管，加入 2 倍体积冰冷的无水乙醇沉淀 DNA，温和混匀；

10. 离心（12000 r/min，30 min，4℃），彻底去除上清；

11. 用 300 µL 70% 预冷的乙醇洗涤沉淀，离心（12000 r/min，15 min，4℃），弃上清，再离心几秒，用移液器彻底除去酒精，风干；

12. 沉淀溶于 100 µL TE 溶液中，-20℃保存；

13. 以紫外分光光度法和 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 浓度和质量。