重叠PCR—overlapPCR

1、简介 
重叠PCR也是基本的PCR原理：变性-退火-延伸。不同的是在重叠PCR过程是两个或者几个片段重叠延伸之后，再进行指数扩增的PCR过程。  
2、基本原理

*步：PCR产生两个或者几个片段，这几个片段之间必须有重叠区。 
第二步：以两个片段为例，见上图，*步产生的两个片段，A D链之间有互补，B C链之间也有互补，但只有A D链互补重叠延伸产生所需要的重叠片段。 
第三步：第二步产生的重叠产物，在上下游引物的存在下，即可进行PCR扩增过程。 请仔细看清楚原理，特别是第二步。  

3.实际操作注意点 

a.*步PCR之后的产物，可以纯化，也可以吸取几μL作为重叠PCR的模板。 

b.第二步和第三步一起称为重叠PCR，实际发生过程分为两个步骤。 

c.Taq酶会在末端加A，高保真酶有3’— 5’的外切活性，基于重叠PCR原理和酶的性质，*步和重叠PCR步骤至少有一步使用高保真酶（或者如Taq Plus、EsTaq之类的，有3’— 5’的外切活性），如果*步和重叠PCR都使用普通Taq可能重叠PCR会失败。

d.基于重叠PCR原理，上图中第二步A D 链直接的退火很关键，所以有些protocol会建议重叠PCR分两个程序进行也是基于以上原理。重叠区的Tm很关键，或者说退火温度很重要。  

4.重叠PCR几个应用场景 

.片段中间引入突变

b.片段中间引入缺失

C.片段中间引入插入片段

d.片段拼接(如不同结构域DNA pian段拼接) 

e.长片段分段扩增，再重叠PCR拼接

f.从基因组扩增出外显子，再拼接出完整的CDS区