重组的果蝇NAP－1的表达和纯化实验

实验方法原理

实验材料 晚对数期的悬浮培养的SFP细胞

试剂、试剂盒 高滴度的 His－NAP－1 杆状病毒储液（Orbigen）磷酸缓冲盐溶液（PBS）裂解缓冲液 H洗涤缓冲液 H洗脱缓冲液 HHEGD 缓冲液NAP－1 纯化缓冲液 Ni－NTA牛血清白蛋白（BSA）标准 乙醇液氮

仪器、耗材 离心机Wheaton 杜恩斯匀浆器MWCO 透析管FPLC装置

实验步骤

1.实验前准备

1.1材料

晚对数期的悬浮培养的SFP细胞（＞2×106 细胞/ml）

1.2 试剂

高滴度的 His－NAP－1 杆状病毒储液（Orbigen）

磷酸缓冲盐溶液（PBS），冰冷

裂解缓冲液 H

洗涤缓冲液 H

洗脱缓冲液 H： 含有 480 mmol/L 咪唑的洗涤缓冲液 H

含有 0.1 mol/L NaCl 的 HEGD 缓冲液

含有 0.0、0. 1、1.0 mol/L NaCl 的 NAP－1 纯化缓冲液

牛血清白蛋白（BSA）标准，2 mg/ml （Pierce， Cat.No.23209）

Source 15Q 树脂（Amersham Pharmac1a B1otech）

20％ （V/V）乙醇

8％ 和 15％ SDS-PAGE 凝胶

液氮

1.3 耗材

Ni－NTA 琼脂糖树脂（Qiagen）

带有倾斜斗转子的临床离心机，4℃

适用于临床离心机的 250 ml 圆锥形离心瓶

40 ml Wheaton 杜恩斯匀浆器，A 型研磨棒

Sorvall Superspeed离心机，带有 SS-34 转子（或相当的物品）

15 ml和 50 ml 锥形管

直立圆筒旋转混合器

12 000～15 000 MWCO 透析管

HR－5 或 HR－10 FPLC 柱（Amersham Pharmac1a B1otech） FPLC装置

硅烷化的 1.5 ml 聚丙烯管子（如 ISC B1oExpress， Cat.＃ C－3302－1）

2. Sf9 细胞在 500 ml 或 1000 ml 旋转式培养瓶中生长至 ＞2.0×106 细胞/ml。用培养基稀释至 1.0×106 细胞/ml。每升细胞培养液使用 25 ml 扩增的 His－ NAP－1 病毒感染。

3. 感染 72 h 后，4℃，在 250 ml 锥形瓶中使用临床离心机 2000 r/min 离心 5 min 收集 细胞。用冰冷的 PBS 重悬细胞（0.1 体积的原细胞培养体积）。重复离心。

从这一步开始，除非明确指出，在冰上或冷室进行所有的操作，所有的溶液都应为 4℃。细胞沉淀可以在液氮中速冻并在进一步的操作前于 -80℃ 保存几周。

4. 用裂解缓冲液 H（1/40 原细胞培养体积）重悬细胞。在 Wheaton 杜恩斯匀浆器中使用 A型研磨棒在 30 min 时间里匀浆 40 次。4℃，14 500 g （SS－34 转子 11 OOOr/ min） 离心 10 min。将所有的上清液集中到一个 50 ml 锥形管中。

5. 每 500 ml 原细胞培养体积取 1 ml Ni－NTA 琼脂糖树脂在裂解缓冲液 H 中平衡。加入细胞抽提物，并在直立圆筒旋转混合器上孵育 3～4 h。使用临床离心机 4℃， 2000 r/min 离心 5 min 收集树脂。用 100 ml 裂解缓冲液 H 洗涤树脂两次，然后用 100 ml 洗涤缓冲液 H 洗涤树脂两次，每次加入缓冲液后，颠倒管子重悬树脂，每次洗涤后，在临床离心机中 2000 r/min 离心 3 min 收集树脂。

6. 用 2 ml 洗脱缓冲液重悬树脂，轻轻振荡以洗脱蛋白质。冰浴 5 min。在临床离心机中 2000 r/min 离心 3 min， 将上清液转移到冰上的新的管子中。重复洗脱循环 3 次 以上，将洗脱液集中到一起。

7. 将洗脱的 NAP－1 在 12 000～15 000 MWCO 透析管中对 4L 含有 0.1 mol/L NaCl 的 HEGD缓冲液进行透析 2 次，每次 2 h。

8. 对 4L 含有 0.1 mol/L NaCl 的 NAP－1 纯化缓冲液再透析 2 h。

9. 将透析好的溶液转到 15 ml 锥形管中，4℃，14 500 g （SS－34 转子 11 000 r/min） 离心去除沉淀。将透析好的 NAP－1 蛋白与 BSA 标准同时进行 SDS-PAGE 电泳分析，以估计蛋白质的数量。

10. 使用 FPLC，根据操作规程将 Source 15Q 树脂装入 HR－5 或 HR－10 柱。每 5 mg 步骤 8 中的 NAP－1 装柱 1 ml 树脂。用 10 倍柱体积的含有 0.1 mol/L NaCl 的 NAP l 纯化缓冲液平衡 Source 15Q 柱。

11. 将 NAP－1 上样到 Source 15Q 柱上。用 10 倍柱体积的含有 0.2 mol/L NaCl 的 NAP－1 纯化缓冲液洗涤样品。用 20 倍柱体积的含有 0.2～0.5 mol/L NaCl 梯度的 NAP－1 纯化缓冲液洗脱蛋白质。

早期的峰（低盐）对组装有抑制作用，而晚期的峰（高盐）却可以激活。14 kDa 的条带（见第 8 步）与早期的峰（抑制作用）一起被洗脱出来。收集 0.25～0.5 柱体积的组分。

12. 每个组分各取 2 ul 进行 15％ SDS－PAGE 凝胶电泳以确定含有纯的 NAP－1 的组分。将蛋白峰合并后透析两次，每次对 2L 含有 0.1 mol/ L NaCl 的 NAP－1 纯化缓冲液透析 2 h。

13. 将透析好的 NAP－1 蛋白与 BSA 标准同时进行 8％ SDS－PAGE 电泳分析，确定蛋白质的浓度。将得到的溶液分装于 1.5 ml 硅烷化的管子中，每管 100～200 ul，并用液氮速冻，保存于-80℃。