重组蛋白质的代谢标记实验

蛋白质

胎牛血清 甲硫氨酸 半胱氨酸

培养瓶 离心机 转子

1.  接种2.5×10⁶细胞于盛有4 ml 含10%胎牛血清的完全培养液的60 mm 肌组织培养皿中。对每一假定重组病毒分别准备一个平皿供感染用，并准备一个对照平皿供野生型杆状病毒感染。于27℃温育2 h。使细胞贴壁。吸出培养液，然后加入1 ml 含重组病毒或1 ml 含野生型病毒的无血清完全培养液，感染复数（MOI）为5~10。

2.  将每个平皿中的培养液移去后，再往其中加入3 ml 含10%胎牛血清的完全培养液， 27℃温育约40 h。

3.  小心去除培养液，用不含甲硫氨酸或不含甲琉氨酸和半胱氨酸的培养液洗细胞一次， 加入1 ml 已添加EXPRE³⁵S³⁵S至0.25~0.5 mCi/ml 的同样培养液。于27℃温育3~4 h。

4.  将细胞和培养物上清移至一支15 ml 聚丙烯离心管，4℃ 1 000 g 离心10 min。
 

5.  进行SDS-PAGE分离裂解物中的蛋白。每条泳道加20~40 μg 细胞总蛋白或全部的免疫沉淀物。

6.  用放射自显影使蛋白质显迹。从放射自显影图查看感染了重组病毒（而不是野生型杆状病毒）的细胞是否出现预期分子量的蛋白质。